全基因组CRISPR-Cas9基因敲除和转录激活筛选实验
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简介
可编程核酸酶已成为一种新的有前途的基因扰动技术，能够精确识别和切割目标 DNA,特别是来自微生物的 CRISPR （簇状规则间隔短回文重复序列）免疫系统的 RNA 引导的核酸内切酶 Cas9 已被证明对 DNA 的精确修饰具有强大的功能。与大型混合单向导 RNA（sgRNA）文库一起，Cas9 可以介导许多表型的高通量LOF和功能获得 (GOF) 研究，并阐明复杂的生物学问题。作为 CRISPR- Cas9 系统用于筛选的实用性证明，基因组规模的 CRISPR-Cas9 敲除 (GeCKO) 和协同激活介体 (SAM) 文库被用于鉴定敲除或激活后对 BRAF 抑制剂 vemurafenib 产生抗性的基因。目前，全基因组 CRISPR-Cas9 基因敲除和转录激活筛选实验主要有包括：设计自定义的 sgRNA 文库【方法一标准名称】、【方法二标准名称】和【方法三标准名称】。
原理
全基因组 CRISPR-Cas9 基因敲除和转录激活筛选实验的基本原理是 Cas9 是由与 DNA 形成 Watson-Crick 碱基对的短 RNA 引导至特定的基因组靶标，因此， Cas9 在目标基因位点上产生精确的双链断裂 (DSB)，可通过同源定向修复 (HDR) 或更常见的非同源末端连接 (NHEJ) 进行修复回。HDR 使用同源 DNA 模板精确修复 DSB ,而 NHEJ 容易出错并引入插入缺失。当 Cas9 靶向编码区时，功能缺失 (LOF) 突变可能会由于移码插入缺失而发生，从而产生无功能的蛋白质。这些功能使 Cas9 非常适合进行基因组编辑。除了产生 LOF 突变外，Cas9还可以通过将无催化活性的 Cas9 (dCas9) 融合到转录激活和抑制域来调节转录，而不会改变基因组序列。CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 抑制 (CRISPRi) 可以通过直接融合或募集激活和抑制域（例如 VP 64 和 KRAB）来实现。
来源：丁香实验团队
操作方法
尽管每个 sgRNA 文库都是为特定目的而计算设计的，但基本的设计过程在文库之间是一致的。首先，根据已知的 sgRNA 靶向规则（如保守外显子 5' 用于基因敲除，转录起始位点的上游或下游分别用于转录激活或抑制），确定感兴趣的靶向 sgRNA 文库的基因组区域。其次，根据以下四个标准识别和选择 Cas9 同源特异性前间区序列邻近基序 (PAM) 的所有可能的sgRNA靶标，要求：① 脱靶活性最小化
克隆自定义 sgRNA 文库在整个 sgRNA 文库克隆和扩增过程中，要尽量减少任何可能影响筛选结果的潜在偏差。
混合的 sgRNA 库的扩增在整个 sgRNA 文库克隆和扩增过程中，要尽量减少任何可能影响筛选结果的潜在偏差。例如，在混合的 Oligo 文库合成过程的初始扩增中，应该限制 PCR 循环的数量，以防止在扩增过程中引入偏差。根据库的大小调整克隆过程的每个步骤，以减少 sgRNA 代去性的损失。sgRNA 文库转化后，限制生长时间以避免可能导致质粒扩增偏差的菌落竞争。
二代测序确定 sgRNA 文库的 sgRNA 分布插入缺失率可以用 SURVEYOR 核峻酶测定法或新一代测序技术测定，新一代测序技术更适合对大量 sgRNA 作用杷标位置进行采样。
慢病毒产生和滴度根据所需的用途，sgRNA 库可以由慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒（AAV）提供。慢病毒和逆转录病毒整合到基因组中，而腺相关病毒不整合， 因此对于筛选，腺相关病毒的递送仅限于非分裂细胞。相反，逆转录病毒只转导分裂细胞。此外，与慢病毒和逆转录病毒相比，腺相关病毒的插入容量更小。因此，到目前为止，大多数的筛选依赖慢病毒递送。
慢病毒转导和筛选根据所需的用途，sgRNA 库可以由慢病毒、逆转录病毒或腺相关病毒（AAV）提供。慢病毒和逆转录病毒整合到基因组中，而腺相关病毒不整合， 因此对于筛选，腺相关病毒的递送仅限于非分裂细胞。相反，逆转录病毒只转导分裂细胞。此外，与慢病毒和逆转录病毒相比，腺相关病毒的插入容量更小。因此，到目前为止，大多数的筛选依赖慢病毒递送。
收集基因组DNA用于筛选分析利用 CRISPR 进行基因组敲除和转录激活的筛选［以筛选 BRAFV6OOE （A375）细胞系中对 BRAF 抑制剂维莫非尼（PLX）有抗性的基因为例］。由于选择压力，与基线和对照条件相比，实验条件下的 sgRNA 文库分布应产生显著偏差，靶向 sgRNA 和非靶向的 sgRNA 相比有明显的差异。此外，在实验条件和对照条件之间 sgRNA 的相对富集或缺失应该与不同的感染复制相关。根据筛选的
验证候选基因以筛查表型考虑到筛选过程可能很复杂，并且分析产生了一个候选基因的排序列表， 有必要验证已识别的候选基因对表型的干扰。为了验证，每个针对候选基因的 sgRNA 都可以单独克隆到 sgRNA 文库的质粒主链中，并验证其筛选表型。此外，还可以量化每个 sgRNA 诱导的干扰，分別用于敲除和激活筛选的插入缺失和转录激活率，以建立表型与基因型的关系。
