混合的 sgRNA 库的扩增

在整个 sgRNA 文库克隆和扩增过程中，要尽量减少任何可能影响筛选结果的潜在偏差。例如，在混合的 Oligo 文库合成过程的初始扩增中，应该限制 PCR 循环的数量，以防止在扩增过程中引入偏差。根据库的大小调整克隆过程的每个步骤，以减少 sgRNA 代去性的损失。sgRNA 文库转化后，限制生长时间以避免可能导致质粒扩增偏差的菌落竞争。

器材：Axygen 八连排 PCR 管、Axygen PCR 96 孔板、离心管等

试剂：

① 混合的 Oligo 文库（Twist Bioscience 或 CustomArray）

② 用于扩增 Oligo 文库以进行克隆的 PCR 引物。长度大于 60 bp 的引物可 作为 4 nmol 超聚物（Integrated DNA technologies）订购。

③ 高保真 PCR 预混液，2 X（New England BioLabs, cat. no. M0541L）。为了 最大限度地减少寡核昔酸扩增中的错误，使用高保真聚合酶非常重要。其他 高保真聚合酶，例如 PfuUltra II（Agilent）或 Kapa HiFi（Kapa Biosystems）也 可以用作替代品。为了扩增高多样性义阡：（例如 sgRNA 文库），推荐使用 NEBNext 高保真 PCR 预混液。

④ 不含 DAN 酶 / RNA 酶的超纯蒸儒水（Thermo Fisher, cat. no. 10977023）

⑤ QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen, cat. no. 28104）

⑥ QIAquick 凝胶提取试剂盒（ Qiagen, cat. no. 28704）

⑦ TBE 缓 7 中液，10 X（Thermo Fisher, cat. no. 15581028）

⑧ SeaKem LE 琼脂糖（Lonza, cat. no. 50004）

⑨ SYBR Safe DNA 染料，10000X（Thermo Fisher, cat. no. S33102）

⑩ 1 kb Plus DNA ladder（Thermo Fisher, cat. no. 10787018）

⑪ 50 bp DNA ladder（Thermo Fisher, cat. no. 10416014）

⑫ Tracklt Cyan/Orange 缓冲液（Thermo Fisher, cat. no. 10482028）

⑬ FastDigest Esp3 I（BsmB I ; Thermo Fisher, cat. no. FD0454）

⑭ FastAP 热敏碱性磷酸酶（Thermo Fisher, cat. no. EF0651）

⑮ DTT, 分子等级（Promega, cat. no. P1171）

⑯ Gibson Assembly Master Mix（New England BioLabs, cat. no. E2611L）

⑰ GlycoBlue Coprecipitant（Thermo Fisher, cat. no. AM9515）

⑱ 异丙醇（Sigma-Aldrich, cat. no. I9516-25 mL）

⑲ 氯化钠溶液（Sigma-Aldrich, cat. no. 71386·1 L）

⑳Tris-EDTA 缓冲液 （Sigma-Aldrich, cat. no. 93283-100 mL）。

混合的 sgRNA 库的扩的基本过程可分为如下几步：

A. 混合的 sgRNA 文库转化。使用 Endura ElectroCompetent 细胞，以 50~100 ng/μL 文库进行电穿孔。如果从 Addgene 扩增一个现成的基因组规模的 文库，需对该文库中的每 10000 sgRNA 重复 I 次电穿孔。如果扩增自定义 sgRNA 文库，则在文库中每 5000 个 sgRNA 中重复 I 次电穿孔，并为对照 Gibson 反应添加一个额外的电穿孔。

B. sgRNA 文库的每个电穿孔反应都需要在 37 °C 预热 1 个大 LB 琼脂平板（245 mm² 生物测定皿，氨芋青霉素）。每个大 LB 琼脂平板均可替换为 10 个标准 LB 琼脂平板。预热 1 个标准 LB 琼脂板（100 mm 培养皿，氨卡青霉素）， 用于计算 37 °C 时的电穿孔效率。为了扩增自定义 sgRNA 文库，请加入另外一 个用于对照 Gibson 反应的标准 LB 琼脂平板。

C. 复苏 1 h 后，混合电穿孔细胞，并颠倒混合均匀。

D. 准备稀释液以计算转化效率。准备稀释混合物，将 10 μL 混合的电 穿孔细胞添加到 990 μL LB 培养基中进行 100 倍稀释，并充分混合。然后将 100 pL 的 100 倍稀释液添加到 900 μL 的 LB 培养基中以进行 1000 倍的稀释并充分混合。

E. 将 100 μL 的 1000 倍稀释液接种到预热的标准 LB 琼脂平板上（来自步骤 B 的 100 mm 培养皿，氨节青霉素）。这是完全转化的 10000 倍稀释度，将 用于估算转化效率。

F. 如果扩增自定义的 sgRNA 文库，重复步骤 D~E 的对照 Gibson 反应。

G. 要铺板混合的电穿孔细胞，向步骤 C 中混合的电穿孑 L 细胞中加入 1 体 积的 LB 培养基，混合均匀，然后铺在较大的 LB 琼脂平板（选项 A）或标准 LB 琼脂平板（选项 B）上。

1. 在大 LB 琼脂板上铺板

使用细胞涂布器将 2 mL 电穿孔的细胞铺板到步骤 B 中的每个预热的大 LB 琼脂平板上。涂布液体培养物，直到被琼脂充分吸收，并且当平板倒置时 不滴落。同时，确保液体培养基没有完全变干，变干会导致生长不良。

2. 在标准 LB 琼脂板上铺板

或者，使用与少骤 GA 中所还相同的技术，在步骤 B 中每个预热标准 LB 琼脂平板上接种 200μL 电穿孔细胞。关键步骤：均匀涂布电穿孔细胞对于 防止可能导致 sgRNA 文库分布不均而造成的菌落竞争很重要。

H. 将所有 LB 琼脂板在 37 °C 下孵育 12~14 h。关键步骤：限制细菌生长 时间为 12~14 h, 确保 sgRNA 文库扩增有足够的生长时间，而没有通过菌落 间竞争或菌落生长速率的差异而潜在影响 sgRNA 文库的分布。

I. 计算电穿孔效率。数一数 10000 倍稀释板上的菌落数目。将菌落的 数量乘以 10000 和电穿孔的数量，就得到了所有平板上的菌落总数。如果从 Addgene 扩增现成的 sgRNA 文库，则仅当该库中每个 sgRNA 的菌落总数大 于 100 个菌落时才继续操作。如果扩增自定义 sgRNA 库，只有当库中每个 sgRNA 超过 500 个菌落时才继续。关键步骤：每个 sgRNA 获得足够数量的菌 洛对一于确保保留完整的文库代表且扩增过程中 sgRNA 不会脱落至关重要。

J. 此外，要扩增自定义 sgRNA 文库，需计算对照 Gibson 反应的电穿孔 效率，并且仅在 sgRNA 文库中每个电穿孔的菌落数比对照 Gibson 反应多 20 倍以上时，才进行操作。

K. 从 LB 琼脂平板上收集菌落。移取 10 mL LB 培养基到每个大 LB 琼脂 平板上，或 1 mL LB 培养基到每个标准 LB 琼脂平板上。用细胞涂布器轻轻刮 取菌落，并将刮取菌落的液体转移到 50 mL 离心管中。

L. 对于每个 LB 琼脂平板，重复步骤 K，共洗涤 2 次 LB 培养基以收集所有残留细菌。

M. 通过测仙收获的细菌悬浮液的 OD 倾来计算所需的最大准备量(maxiprep)： maxiprep= OD₆₀₀₆₀₀，并测量稀释液的 OD₆₀₀。然后将 OD₆₀₀ 乘以稀释倍数以获得细菌悬液的 OD₆₀₀。2 块密集接种的大 LB 琼脂平板大约需要 1 个 maxiprepoN 混合所得质粒 DNA 并通过 NanoDrop 进行定量。可以将 Maxi prepped sgRNA 文库等分并保存在 -20 ℃ 下。