克隆自定义 sgRNA 文库

在整个 sgRNA 文库克隆和扩增过程中，要尽量减少任何可能影响筛选结果的潜在偏差。

器材：Axygen 八连排 PCR 管、Axygen PCR 96 孔板、离心管等

试剂：

① 混合的 Oligo 文库 (Twist Bioscience 或 CustomArray)

② 用于扩增 Oligo 文库以进行克隆的 PCR 引物。长度大于 60 bp 的引物可 作为 4 nmol 超聚物 (Integrated DNA technologies) 订购。

③ 高保真 PCR 预混液，2X （New England BioLabs, cat. no. M0541L）为了最大限度地减少寡核昔酸扩增中的错误，使用高保真聚合酶非常重要。其他 高保真聚合酶，例如 PfuUltra II （Agilent）或 Kapa HiFi （Kapa Biosystems）也 可以用作替代品。为了扩增高多样性义阡：（例如sgRNA文库），推荐使用 NEBNext高保真PCR预混液。

④ 不含 DAN 酶/ RNA 酶的超纯蒸儒水 (Thermo Fisher, cat. no. 10977023)

⑤ QIAquick PCR 纯化试剂盒 (Qiagen, cat. no. 28104)

⑥ QIAquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen, cat. no. 28704)

⑦ TBE 缓 7 中液，10X (Thermo Fisher, cat. no. 15581028)

⑧ SeaKem LE 琼脂糖 (Lonza, cat. no. 50004)

⑨ SYBR Safe DNA 染料，10000X (Thermo Fisher, cat. no. S33102)

⑩ Ikb Plus DNA ladder (Thermo Fisher, cat. no. 10787018)

⑪ 50 bp DNA ladder (Thermo Fisher, cat. no. 10416014)

⑫ Tracklt Cyan/Orange 缓冲液 (Thermo Fisher, cat. no. 10482028)

⑬ Fast Digest Esp3 I (BsmB I ; Thermo Fisher, cat. no. FD0454)

⑭ Fast AP 热敏碱性磷酸酶 (Thermo Fisher, cat. no. EF0651)

⑮ DTT,分子等级 (Promega, cat. no. P1171)

⑯ Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs, cat. no. E2611L)

⑰ Glyco Blue Coprecipitant (Thermo Fisher, cat. no. AM9515)

⑱ 异丙醇 (Sigma-Aldrich, cat. no. I9516-25 mL)

⑲ 氯化钠溶液 (Sigma-Aldrich, cat. no. 71386 · 1 L)

⑳ Tris-EDTA 缓冲液 (Sigma-Aldrich, cat. no. 93283-100 mL)

克隆自定义 sgRNA 文库的基本过程可分为如下几步：

A. 在整个 sgRNA 文库克隆过程中，请参照表 9.7 或每个克隆步骤中推荐的反应数，得到含有 100000 个 sgRNA 的文库，并根据自定义 sgRNA 文库的大小调整反应数。

B. 使用 Oligo 正向和 Oligo 反向引物扩增 Oligo 库。根据表 9.8 列出的反应比制备主混合物。

关键步骤：为了最大限度地减少 Olig。扩增错误，使用高保真聚合酶非 常重要。其他高保真聚合酶，例如 PfuUltra II（Agilent）或 Kapa HiFi（Kapa Biosystems），也可以用作替代品。

C. 将 PCR 预混液分装成 25 μL 反应液，并使用以下循环条件（表 9.9）。

关键步骤：在扩增过程中，将 PCR 循环周期限制在 20 个循环，以减少 扩增过程中的潜在偏差。

D. 反应完成后，用 QIAquick PCR 纯化试剂盒对 PCR 产物进行纯化。用 NanoDrop 对产品进行量化。

E. 取一半步骤 ⑤ 中纯化的 Oligo 文库在质量浓度 20 g/L 的琼脂糖凝胶上 电泳 45 min。

关键步骤：在琼脂糖凝胶上电泳足够长的时间，以使目标文库（140 bp）与可能的约 120 bp 引物二聚体分离。在以上建议的优化 PCR 条件下， 引物二聚体的存在应降至最低。

F. 凝胶提取纯化后的 PCR 产物使用 QIAquick 凝胶提取试剂盒提取，并使用 NanoDrop 对最终产物进行定量。

G. 质粒主链的限制酶切。用在 sgRNA 目标区域周围切割的限制酶 Esp3 I（BsmB I）酶切所需的文库质粒主链。请参考表 9.10 设置的预混料反应比。

H. 从预混物中分装 20 μL 反应液，并将限制性酶切反应液在 37 ℃ 下孵育 1 h。

I. 反应完成后，将第 H 步的限制酶切反应液汇集起来，用 SYBR 染料 在 TBE 缓冲液中浇铸 2% 的琼脂糖凝胶，并在 15 V/cm 的凝胶中进行 30 min 电泳。使用 QlAquick 凝胶提取试剂盒提取文库质粒主链，并使用 NanoDrop 进行定量。请注意，Gecko 库的主链包含一个 1880 bp 的填充序列，它应该作 为分离条带可见。SAM 库的主链不包含填充序列，通常不容易看到预期的 20 bp 的缺失。

J. Gibson 组装。根据表 9.11 所示的反应比率，在冰上加入 Gibson 预混 液。确保包含无 sgRNA 库的反应作为对照。

K. 从预混液中分装 20 μL 反应液，然后将 Gibson 反应液在 50 °C 下孵育 1 h＜： 完成的 Gibson 反应可在 -20 °C 下储存至少 1 周。

L. 异丙醇沉淀。分别进行克隆和对照反应。通过混合表 9.12 所示步骤纯化和浓缩 sgRNA 文库。

关键步骤：除了浓缩反应库外，异丙醇沉淀法还可从 Gibson 反应中除去干扰电穿孔的盐。

M. 涡旋并在室温下孵育 15 min, 然后在 ＞ 15000 Xg 下离心 15 min 以沉淀质粒 DNAo 沉淀的质粒 DNA 在离心管底部应显示为浅蓝色的小沉淀。

N. 吸出上清液，并用 ImL 冰冷（-20℃）的体积分数 80% 的乙醇轻轻洗涤沉淀两次。

O. 小心除去残留的乙醇，风干 1min。

P. 通过在 55°C 下孵育 10 min, 将质粒 DNA 沉淀重悬于 5 μL TE 中，并 通过 NanoDrop 定量自定义的 sgRNA 文库。异丙醇纯化的 sgRNA 文库可以 在 -20 ℃ 下保存几个月。