收集基因组DNA用于筛选分析

利用 CRISPR 进行基因组敲除和转录激活的筛选［以筛选 BRAFV6OOE （A375）细胞系中对 BRAF 抑制剂维莫非尼（PLX）有抗性的基因为例］。由于选择压力，与基线和对照条件相比，实验条件下的 sgRNA 文库分布应产生显著偏差，靶向 sgRNA 和非靶向的 sgRNA 相比有明显的差异。此外，在实验条件和对照条件之间 sgRNA 的相对富集或缺失应该与不同的感染复制相关。根据筛选的类型（阳性、阴性或标记基因选择），sgRNA 的富集或缺失将被用来鉴定具有筛选表型的候选基因。

器材：离心管、离心机等。

试剂：

① Quick-gDNA MidiPrep（Zymo Research, cat. no. D3l00）

② DNA 结合缓冲液（Zymo Research, cat. no. D4004-1-L）

③ DNA 洗涤缓冲液（Zymo Research, cat. no. D4003-2-24）

④ DNA 洗脱缓冲液（Zymo Research, cat. no. D3004-4-4）

⑤ 纯乙醇（Sigma-Aldrich, cat. no. 459844?500 mL）

⑥ 用于克隆验证 sgRNA 的引物（Integrated DNAtechnologies）

⑦ T4 多核昔酸激酶（New England BioLabs, cat. no. M0201S）

⑧T4 DNA 连接酶反应缓冲液，10X（New England BioLabs, cat. no. B0202S）

⑨ T7 DNA 连接酶 2X 快速连接缓冲液（Enzymatics, cat. no. L6020L）

⑩ 牛血清蛋白，分子生物学等级（New England BioLabs, cat. no. B9000S）

⑪ QuickExtract DNA 提取溶液（Epicentre, cat. no. QE09050）

⑫ RNase AWAY（VWR, cat. no. 53225-514）

⑬ 蛋白酶 K（Sigma-Aldrich, cat. no. P2308-25 mg）

⑭ Tris. Imol/L, pH 8.0（Thermo Fisher, cat. no. AM9855 G）

⑮ Deoxyribonuclease I bovine（Sigma-Aldrich, cat. no. D2821-50KU）

⑯ UltraPure 1 mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5（Thermo Fisher, cat. no. 15567027）

⑰ 氯化钙溶液（Sigma-Aldrich, cat. no. 21115-lmD

⑱ 甘油（Sigma-Aldrich, cat. no. G5516-100 mL）

⑲ MgCl2, 1 mol/L（Thermo Fisher, cat. no. AM9530 G）

⑳ Triton X-l 14（Sigma-Aldrich, cat. no. XI14-1 OOmL）

21. 蛋白酶 K 抑制剂（EMD Millipore, cat. no. 539470-10 mg）

22. 二甲亚飒（Sigma-Aldrich, cat. no. D8418~50 mL）

23. 乙二醇■双（2-氨基乙基醍）-N, N, N， Nf -四乙酸（SigmaAldrich, cat. no. E3889-10 g）

24. Revert A id RT 逆转录试剂盒（Thermo Fisher, cat. no. K1691）

25. Oligo dT（TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTNN; Integrated DNA Technologies）

26. TaqMan 目标探针，FAM 染料（Thermo Fisher）

27. Taqman 内源性对照探针，VIC 染料（如 Human GAPD, GAPDH, 内源 对照 VIC®/MGB 探针，弓物限制性；Thermo Fisher, cat. no. 4326317E）

28. TaqMan Fast Advanced Master Mix, 2 X（Thermo Fisher, cat. no. 4444557）

收集基因组DNA用于筛选分析的基本过程可分为如下几步：

A. 收获基因组 DNAO 在筛选结束时，从足够数量的细胞中收获基因组 DNA（gDNA），以保持 ＞500 个细胞的覆盖率。对于包含 100000 个独特sgRNA 的文库，请根据制造商的方法，使用 Zymo Research Quick-gDNA MidiPrep 从至少5X107个细胞中收获 gDNA 用于下游 sgRNA 分析。应以 150~200 μL 进行两次洗脱，以最大限度地回收 gDNA 。关键步骤：确保拧紧收集管和色谱柱之间的连接并以足够的速度和时间进行离心分离，以除去所有残留的缓冲液。建议最后再进行干燥离心以去除残留的洗涤缓冲液。冻存的细胞沉淀 或分离的 gDNA 可以在 -20 ℃ 下保存几个月。

B. 制备 gDNA 以进行二代测序分析。扩大反应数量，以便扩增所有从筛选中收集的 gDNA。每个 50 μL 反应最多可容纳 2.5 μg gDNA。条形码 NGS-Lib-Rev 引物可在混合测序程序中对不同筛选条件和bioreps（即实验条件 biorep 1 和对照条件 biorep 1）进行测序。

C. 扩增筛选NGS文库的纯化。对于大规模 PCR 纯化，建议将 Zymo~Spin V 与收集管一起使用。将 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液添加到 PCR 反应 中，充分混合，然后转移至 Zymo-SpinV 与收集管。每个 Zymo-SpinV 色谱 柱最多可容纳 12 mL。关键步骤：确保收集管和 Zymo-Spin V 色谱柱之间的连接紧密。

D. 在室温下以 500 Xg 离心 5 min。去除流出液。

E. 加入2 mL DNA的洗涤缓冲液，在室温下以500Xg离心5 min。去除流出液，并重复进行一次洗涤。

F. 从 Zymo-Spin V 色谱柱上取下收集管，然后将色谱柱转移到新的 2 mL 收集管中。在微量离心机中，在室温下以最大速度（> 12000 Xg）旋转 1 min, 以去除残留的洗涤缓冲液。

G. 将 Zymo-Spin V 色谱柱转移到 1.5 mL 离心管中。加入 150 μL 洗脱缓冲 液，等待 1 min, 然后在室温下以最大速度（>12000 Xg）旋转 1.5 min, 以洗脱纯化的 PCR 反应。

H. 混合纯化的 PCR 反应产物并进行定量。为了筛选 NGS 分析，建议席中每个sgRNA的覆盖范围 > 500 个读长。

I. 利用RNAi基因富集排名（RIGER）分析筛选结果。在进行 RIGER 分 析之前，确定由于筛选选择而引起的 sgRNA 倍数变化。对于筛选实验或对照 条件的每个 biorep , 在每个 sgRNA 的二代测序的读取计数中增加一个假计数 1, 并根据该条件下的二代测序读取计数总数进行归一化。若要获得 sgRNA 倍数变化，将实验归一化 sgRNA 计数除以对照，并取以 2 为底的对数。

J. 从左到右准备一个带有列标题 WELL_ID、GENE_1D 和 biorep 1、biorep 2 等的 RIGER 输入 csv 文件。WELLJD 是 sgRNA 识别号的列表，GENEJD 是 sgRNA 靶向的基因，biorep 列是 sgRNA 的倍数变化，每行在库中包含一个不同的 sgRNA。

K. RIGER 是通过博德研究所的 GENE-E（http://www.broadinstitute.org/cancer/ software/GENE-E/download.html）启动的。启动 GENE-E 并通过导航到 」File「〉 」Import「 > u Ranked Lists」来导入输入的 csv 文件。按照说明单击包含第一个 数据行和列的表单元格。通过转到 Tools〉RIGER 启动 RIGERo 将 RIGER 设置调整为以下值：

排列数：1000000。将发夹转化为基因的方法：Kolmogorov-Smimovo 基因排列顺序：从阳性到阴性用于阳性选择筛选；从阴性到阳性用于阴性选择 筛选。选择调整基因得分以适应发夹集大小的变化。选择发夹预评分。发夹 Id:WELLJDo 将发夹转换为：GENEJD。

L. RIGER分析完成后，导出基因排名数据集。根据重叠或筛选 bioreps 之间的平均排名值确定最佳候选基因。