如何收集用于western blot的细胞

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问：我现在在养细胞，然后收细胞抽蛋白以及提 RNA 用，我想先多收点细胞冻着。想问一下怎样收集细胞，有具体的流程吗?

 

我是这样做的：

 

1、将细胞消化吹打后转移至离心管离心

 

2、倒去上清，加 1 mlPBS 打匀后转移至 1.5 ml EP 管

 

3、离心 12000 rpm 2 min (不知道大家这里用多少转速，有讲究吗?)

 

4、倒去上清，我是将 EP 管倒置一会，但是 EP 管里面还是有一些上清，我没有倒干净，请问是不是要倒干净上清啊? 因为我暂时还不抽提，离心后 EP 管是放到-80 度冰箱保存的。这个上清对抽蛋白和 RNA 有影响吗?

 

问题答复：

 

收集流程没有什么特殊的，和你写的一样，主要注意以下事项：

 

1、1 ml 的 PBS 可能溶不了那么多细胞 (如果你细胞多的话)，所以建议用 3 mlPBS，分两管装，离完心后用 Trizol 溶解合成一管

 

2、离心的速度太大了，细胞会死的，建议 800 转，5 分钟，一般的细胞都可以离下来

 

3、需要去上清，如果是提 RNA 就用 Trizol 溶解合成一管，然后放在-80 度冰箱，如果提蛋白就直接将离心后的细胞放在-80 度冰箱。上清对于提蛋白和 RNA 没什么影响。还有一点，提 RNA 的东西一定要高压，如果是初次做可以用 DEPC 水泡枪头，可以提高作成功的几率。如果操作严格，可以只把要用的枪头和 EP 管高压即可。