重组展示病毒滴度的检测

重组展示病毒滴度的检测

材料

试剂

抗体

羊抗鼠辣根过氧化物酶（HRP) 标记的二抗

使用前按 1 :4 〇〇 用 PBS-Tween 稀释。

鼠源性抗_gp6 4 抗体

使用前用 P B S -T 稀释。

杆状病毒 .

蓝辣根过氧化物酶底物

乙醇

固 定 剂（fonny 卜 buffered acetone)

3 0 % PBS

4 5 % 丙 酮

2 5 % 福 尔 马 林（稀 释 自 3 7 % 的甲醛

每 片 500ul, 根据需要固定的量在使用前配制。

盐 酸

去离子水

无血清昆虫细胞培养基（如 HyQ SFX [HyClone], In sect Xpress [Biowhittaker],或 S/-900 II SFM [Invitrogen])

甲 基 纤 维 素（〇. 6 % m/V O 溶 于 昆 虫 细 胞 培 养 基

高温灭菌甲基纤维素，再加人培养基，搅拌过夜。

封 片 液（如 Mowiol; CalWochem)

正 常 山 羊 血 清（NGS)

使用前用 PBS-Tween 以 1 :30 比例稀释。

PBS/Tween (PBS-T , 0. 05%Tween 20)

磷酸盐缓冲液（P B S )

Spodoptera frugiperda（Sf9 ) 细 胞 株（A T C C , C R L - 1 7 1 1 )

仪器

显微镜载玻片（12 孔 ；如 Cel-line)

方 法

1 . 将载玻片放人 7 0 % 乙醇 和 1 % H C l 的溶液中浸泡过夜。 自来水冲洗 1 0 次 ，去离子水 冲 洗 3 次 ， 80°C 孵育过夜。

2 . 收集对数生长期的 S/ 9 细胞，使其密度在 1.5XIO⁶ 个/ml。

3 . 向载玻片的每个孔加入 3 0 4 Sf9 细胞。置于增湿孵化器， 28°C 孵 育 30〜6 〇 min ，让细胞附着于载玻片 上 。

4•用培养基稀释杆状病毒

10^-5、 10^-6 和 10^-7最终稀释已经足够用于滴度检测。

5 . 小心地将培养基从培养细胞上移去，每孔接种 IOul 杆状病毒。每个稀释浓度 4 个孔，并且再做一个复本（如每个样品做两个片）。

6.增湿孵化器内 28°C 孵 育 lh 。

7•除去接种物，每孔加入 40fxl 甲基纤维素。

8 . 用潮湿的纸巾包裹好载玻片放人塑料袋中密封， 28°C 孵 育 2〜3d。

9 . 每孔加入 4CV1 固定剂。室温孵育 5〜lOmin。

不要过度固定，除去甲基纤维素也是没有必要的。

10.除去固定剂，用 PBS^Tween 洗涤载玻片 3 次 ，每 次 5 min。

11.除 去 PBS-Tween，每 孔 加 入 稀 释 的 NGS，室温孵育 5 min。

12.除 去 NGS，每孔加入 15fxl 鼠源抗 gP6 4 抗体，室温孵育 30 min。

13.除去一抗， EBS^Tween 洗 涤 2 次 ，每 次 5 min。

14•除去 PBS——Tween，每 孔 加 人 15jul 稀 释 的 H R P 标记的羊抗鼠 IgG 抗体，室温孵育 25 min0

15.除去二抗， PB^ Tween 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。

16.每孔加入 15p l 过氧化酶底物，显 色 1〜3 h。

17•吸走底物，让载玻片风干。

18.将干燥后的样品封片。

干燥的载玻片通常能够在黑暗环境下保存 1〜2 周。

19.用光学纤维镜对孔内的染色焦点（4〜3 0 个被染色的细胞形成的不连续的细胞簇）计数 ，每个孔有 5〜2 5 个焦点。

2 0 . 对于每个稀释浓度，确定每个孔染色焦点数的平均值。

2 1 . 用焦点的平均数乘以相应的稀释因子和接种正常化因子 1 0 0 , 得到病毒滴度
病 毒 滴 度（pfu/ml) = 每孔中焦点的平均数 X l/稀释因子 X 100。