构建杆状病毒展示文库

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材料

试剂

小牛肠碱性磷酸酶

DNA， Ac-omega 杆状病毒 DNA 和待插入的目的片段

乙 醇（70%)

IPL-41 (粉状培养基， pH6.2±0.1，渗透压约 400mOsmol)

脂质体制剂（Cellfectin; Invitrogen )

苯酚：氯仿

磷酸盐缓冲液（PBS)

2.7m m o l / L K C l

I. 5m m o l / L K H 2P 0 4

136.9m m o l / L N a C l

8.9m m o l / L N a 2 H P O 4 •7 H 20

4℃储存。

I-SceI 大范围核酸酶（Boehringer-M a n n h e i m )

Sf9 昆 虫 细 胞（A T C C ， C R L -1711)

Spodopterafrugiperda (Sf9)

仪器

贴壁细胞培养耗材： T 培养瓶、多孔培养板、培养皿

细胞培养箱（27〜28°C)

一次性用品：一次性试管、微量移液器、 tip 头、无菌过滤器

其他设备：层流罩、水浴锅、大容量离心机（＞10 〇 m l ) ， Spinner 瓶

方法

1 用 IOOul 试剂供应商推荐的缓冲液稀释 1 〇ug的 Ac-omega 病 毒 DNA，加 入 50 单位的 I-SceI 大范围核酸酶，置于 37°C 孵 育 5 h。

2.用小牛肠碱性磷酸酶处理已经线性化的病毒 DNA, 除去 5’端的磷酸基团。

3.苯 酚 ：氯仿抽提 DNA。

4 . 乙醇沉淀 DNA。

5 . 以摩尔数比为 1 : 4 0 的 比例将待插入片段和 1 〇〇〜2 〇〇 n g 经过纯化和去磷酸化的Ac-omega 病毒 DNA 连 接（详见 ErnstetaL 1994)。

6•连接混合物置于 16°C 孵育过夜。

7.往连接混合物中加入 20M1Cellfectin (IOOmI 体系），室温孵育 15 min。

8•用上一步的得到的脂质体/连接复合物转染 2. 5XIO⁶ 个 Sf9 细胞。孵育 6 h。

9•加入含血清的培养基， 27°C 培养 4〜6d。

10.进行蚀斑分析并通过荧光识别的细胞分选仪分析外源蛋白质在细胞表面的表达(FACS; Ernst et al. 1998)。