被感染昆虫细胞表面展示的病毒蛋白质的免疫荧光分析

被感染昆虫细胞表面展示的病毒蛋白质的免疫荧光分析

材料

试剂

抗体

针对目的蛋白或多肽的一抗

焚 光 接 合 的 二 抗（如 A le x a F lu o r D yes; Invitrogen)

杆状病毒：重组展示和野生型

3 % 牛血清白蛋白（BSA) 的 PBS 溶液

DABCO (25m g/m l 溶 于 M ow iol 中 ， Sigm a-A ldrich)

昆虫细胞生长培养基（无血清）

M ow iol (Calbiochem )

4 % 多 聚 甲 醛（溶 于 PBS)

spodoptera frugiperda ( S / 9 ) 细 胞 株（A T C C ， C R L - 1 7 1 1 )

悬浮生长的细胞在转染时细胞密度大约为 2 X IO⁶ 个/ml。

T rito n X - 1 0 0

仪器

细胞培养箱（如用于悬浮细胞培养的旋转培养瓶)

盖玻片

小型离心机

显微镜载片

细胞培养所需的塑料器皿和移液器

方法

1.用重组和野生型病毒（对照）感染约 I O m l 的 Sf9 细胞，感 染 复 数（moi) 为 5〜10。

于 28° C 旋转摇床转速 125r/m i n 培养 24〜28 h 。

2.从每个感染组中收取〇.5〜l m l 细 胞（1 X 1 〇 ⁶ 个 或 2 X 1 〇 ⁶个），于 4° C ， 2 〇〇〇 r/min
离心 3〜4m i n

3 . 吸去培养基，用 〇 • 5〜1m l 预冷的 P B S、心重悬细胞。

4• 于 4 °C ， 2 0 0 0 r /m in 离 心 3 〜 4 m in ，吸 去 培 养 基 。

5.可选步骤，细胞可以经过固定和（或）封闭和渗透处理。

a. 〇.5〜 Iml 4 % 多聚甲醒孵育。

b.4°C 振荡 20m i n 。

c. 于 4°C , 2000r / m i n 离心 3〜4m i n , 吸去固定剂。

作为选择，免疫标记后可 以 对 样 品 进 行 固 定（步 骤 1 0 后）。如果展示的蛋白质具有荧光，则直接进行步骤 11

d. 室温下，用 0.1% Triton X -100-B S A 封闭和渗透细胞 lOmin。
如果一抗识别的展示蛋白质的抗原表位位于细胞外，则没有必要对细胞进行渗透处理。另外 ，一些识别跨膜蛋白质的胞质结构域的抗体能够不需要渗透处理就能够穿过细胞膜。

6.用 P B S 稀释的一抗孵育细胞， 4°C 振 荡 l h。
每 IX IO⁶〜2XIO⁶ 个细胞大约用 2 0 0 0 。

7.4°0,0.5——11111?63 振荡洗涤细胞三次，每次 15min。在每次洗涤细胞后 2000 r/min,4℃离心 3m i n 。

8•加人适量 P B S 稀释的荧光标记的二抗， 4°C 避光振荡孵育 30m i n 。

每 1 x 10⁶—— 2 x1 0 ⁶个细胞大约用 200ul。

9.4℃， 0.5〜1ml PBS 振荡洗涤细胞三次，每次 15min。在每次洗涤细胞后 2000r/min,4°C 离心 3m i n 。

10.吸去上清，用 30〜50fil D A B C O 重悬细胞。

11.将几微升的细胞悬液转移到载玻片，盖上盖玻片，干燥，暗处 4°C 保存。因为在操作过程中细胞数量会减少 20%〜50% ，根据最后的细胞数量调整 DABCO 的体积。

12.用普通荧光显微镜或者是激光共聚焦显微镜分析细胞。