昆虫细胞--高MOI杆病毒感染

 

高 MOI （ Multiplicity Of Infection ，等于用于感染的病毒数目与细胞数目的比值）感染是生产蛋白的最好方法。这有两个原因。一是不用考虑 DIP （ Defective Interfering Particles ，即只包装入部分基因组的病毒颗粒）的形成，因为关心的是细胞或者培养液中的蛋白；二是高 MOI 感染是最便于控制、重复性好的方法，以达到高的蛋白表达水平。

低 MOI 感染也可用于生产蛋白，但是难以控制，难以达到最高的表达量。然而病毒需要量少的确是该法的一个优点，对于大规模的生产这个优点极为有利，只要它们可以可靠的复制，这因不同的重组病毒而异。

一般说来，用高 MOI 感染的方法就是将培养液中所有的细胞同时感染，每个细胞至少感染一个病毒颗粒。这个过程的几率可以用 Poisson 分布来分析，简而言之，如果你想同时把所有的细胞都感染， MOI 值应该接近 3 。由于一旦加入病毒细胞就不再生长，因此你可以精确的控制感染时细胞的密度，这个密度大约应该大约是平台期最大密度的一半。随着细胞株的不同，大约在 1.5~2.5 × 10⁶ 细胞 /ml 之间。

重要的是培养液的量要满足细胞生长的需要，否则将没有足够的营养使细胞生产病毒或者蛋白。另一方面，病毒也不可以太多，以免在细胞增殖到合适密度并用掉所有营养资源之前就被杀死。用高 MOI 感染的方法，这些条件比较容易优化，只需准备密度变化在 1~3 × 10⁶ 细胞 /ml 之间的一系列细胞培养物，以固定的细胞：病毒比例去感染细胞，筛选蛋白产量最高时的那个密度即可。

采用这个方法需要你使用足够量的病毒使细胞生长立即停止。病毒量可以通过进行一个小量实验来确定，先使细胞达到上面确定的最优密度，然后变化病毒的量确定感染率。高 MOI 感染的最大的缺点是需要准备大量的高滴度病毒，这个缺点在大量生产时尤为突出。例如，如果你的病毒不能形成高滴度的溶液，只能达到 3 × 10⁷ pfu/ml 左右，你需要加相当于细胞培养物 20% 体积的病毒。如果细胞的密度为 2.5 × 10⁶ ，体积为 8 升，那么为了得到密度为 2 × 10⁶ 细胞 /ml 的被感染细胞，需要加入 2 升病毒！你的细胞必须能够生长到较高的密度 --2 × 10⁶ 细胞 /ml ，并且保持对数期良好状态，你必须加入相当于终体积 20% 的培养液以达到最终体积，这是实验能够顺利进行下去的极限。

然而，如果你可以得到高滴度的病毒以满足感染的需要，这种方法的产量、可重复性非常高。因此，我建议在表达一个新的蛋白时，开始最好先试用这种方法。并且用这种方法得到的蛋白的产量可作为衡量其它方法（低 MOI 感染）产量的标准。尤其是当你的培养物体积小时（小于 500ml ），这是最好的方法。

步骤

 

将你的细胞以 2~8 × 10⁵ 细胞 /ml 的密度分装到摇瓶或者搅拌器中，达到摇瓶体积的 20~40% ，记得留出一些空间以待于将来加病毒。当培养物的体积小于 500ml 时，我更喜欢用摇瓶。在 27 ± 2 ℃培养，转速为 100~130rpm 。

第 0 天

 

培养细胞至密度达到大约 1.5~2.5 × 10⁶ 细胞 /ml ，即最大密度的一半。这可能需要多于 1 天的时间，与接种密度有关。

加入足够的病毒，以使所有的细胞被同时感染，但是避免加入的病毒体积多于终体积 20% ，最好不要多于 10% 。加入的量取决于病毒的滴度。

如果细胞的密度为 2 × 10⁶ 细胞 /ml ，病毒的滴度为 5 × 10⁷ pfu/ml ，要达到 MOI 值为 3 ，需要加入 12% 体积的病毒。

将摇瓶放回 27 ℃摇床，培养 24 小时。

感染后第 1 天

 

计数细胞，估计细胞大小。如果是在高 MOI 下感染，那么所有的细胞都已经被感染。它们与第 0 天比将不会在数目上增长，并且在细胞形态上显著膨胀。此时很容易看到细胞表面变得粗糙，这是病毒正在出芽的结果。

如果发现细胞数目有所增多，可能是由于对病毒滴度的估计偏高，使得细胞没有全部被病毒感染。这种现象在 MOI 值大于 3 时很少出现，因为一般的杆病毒噬菌斑实验结果通常是低估病毒的滴度。如果细胞数目的增长没有超过 25% ，可能只会影响最佳收获时间。平均每个细胞生产的蛋白量也会稍低。

感染后第 2 天

 

再次计数细胞，估计细胞大小。此时与第 1 天比细胞数目无论如何都不应该再增长。如果增长了，你的感染可能分布不均匀，很可能是病毒滴度低造成的。

此时细胞应该大大膨胀，细胞核占据了细胞的大部分空间。

此时可能是细胞或者培养液的时间了，这因不同的蛋白而异。大多数蛋白的产量在感染后 48~72 小时之间不会再有增长。不过这需要实验来确定。

感染后第 3 天

 

再次计数细胞，估计细胞大小。此时所有的细胞应该已经被彻底感染，细胞膨胀并且生长停止，否则就说明没有足够的病毒使细胞在达到平台期之前停止增长。收获培养物，离心分离细胞，将培养液避光保存于 4 ℃，或者冻存于 -70 ℃。

通常最好将细胞沉淀冻存。我喜欢的方法是将细胞重悬于小量（比如 1/4 体积）的 PBS 或者 TBS （含有浓度为通常 5 倍的蛋白酶抑制剂）中，充分重悬后直接用微量移液器加入充满液氮的干净 Dewar 瓶中。滴下的重悬物遇到液氮迅速冻结形成小球，这些小球可以被分装到 50ml 圆锥管中，冻存于 Revco 冰箱中。当需要从细胞中纯化蛋白时，只需将这些小球逐个加入到 3~5 倍体积室温下不断搅拌的裂解缓冲液中，它们将很快融化，使缓冲液降至接近 0 ℃。这些小球还可以用镊子方便的转移到 eppendorf 管中作小量实验。