昆虫细胞的低MOI杆病毒感染

 

感染悬浮细胞是使杆病毒系统生产蛋白的普遍方法。悬浮培养的细胞很容易从 10ml 扩大到 100L 。一般来说，悬浮的细胞在无血清的培养液中培养。这种培养液许多公司有售，比如 Life Technologies 、 Hyclone 、 Biowhitaker 、 JRH Biosciences 、 Expression Systems 等，用起来都不错，尽管由于细胞株和目的蛋白的不同，效果有所差异。

最好是将目的蛋白和细胞株用不同的培养液做一个表达试验，选出表达效果最好的一种培养液。在进行这个表达试验之前要先使你的细胞株分别适应不同的培养液（见上文），否则试验结果不具有代表性。

注意：为了优化表达，你必须了解你的细胞的生长参数；为了方便新手，我将列出一些生长参数通常的值。我最喜欢的 Sf9 细胞株可以最低以 2 × 10⁵ 细胞 /ml 的浓度分装，并且恢复几乎没有滞后期。在对数期， 20 个小时细胞数目就可以翻倍，浓度最高可以达到 5 × 10⁶ 细胞 /ml 。下面的实验步骤将以上面列出的生长参数为前提。如果你的细胞株生长参数有所不同，你需要对实验步骤做出合适的调整。

低 MOI 感染简介

 

低 MOI （ Multiplicity Of Infection ，等于用于感染的病毒数目与细胞数目的比值）感染是扩增病毒的最好方法。这有两个原因。一方面，低 MOI 感染是最快也是最简单的扩增病毒数量的方法；另外，低 MOI 感染是保存病毒基因的完整性、防止 DIP （ Defective Interfering Particles ，即只包装入部分基因组的病毒颗粒）生成的最好方法。

还可以用低 MOI 感染的方法生产蛋白，但是难以控制，并且不适于提高蛋白产量。然而病毒需要量少的确是该法的一个优点，对于大规模的生产这个优点极为有利，只要它们可以可靠的复制，这因不同的重组病毒而异。对于小规模的蛋白生产，我更喜欢用高 MOI 感染。

一般而言，低 MOI 感染的方法就是先用病毒感染少量细胞，这些被感染的细胞复制出足够的病毒，去感染培养物中剩余的尚未被感染的细胞，而这第二批被感染的细胞就是病毒或者蛋白的主要生产者。

重要的是培养液的量要满足细胞生长的需要，否则将没有足够的营养使细胞生产病毒或者蛋白。另一方面，病毒也不可以太多，以免在细胞增殖到合适密度并用掉所有营养资源之前就被杀死。最理想的是，先确定在没有病毒感染时，细胞保持正常状态所能达到的最大密度，那么如果病毒的量能够使细胞在达到该密度的 1/3~2/3 时停止扩增是最理想的。我通常是使用该密度的 1/2 。

采用这个方法需要使用足够的病毒感染细胞，在 24~48 小时内使细胞停止增长、所有的细胞都被感染。因此，以生长停止作为完全感染的标志，培养物在达到完全感染后可以继续生长大约 48 小时。如果以生产蛋白为目的，这个过程可能需要更长。

步骤：

 

将细胞以 2~4 × 10⁵ 细胞 /ml 的密度分装到摇瓶中，达到摇瓶体积的 20~40% 。在 27 ± 2 ℃培养，转速为 100~130rpm 。

第 0 天

 

培养细胞至密度达到 4~8 × 10⁵ 细胞 /ml ，即已经进入对数期生长，但是仍处于低浓度。

然后加入少量病毒，病毒量依赖于滴度，但是最好使 MOI 值介于 0.1~0.5 。比如，如果你的细胞浓度为 6 × 10⁵ 细胞 /ml ，而病毒滴度为 3 × 10⁷ pfu/ml ，那么要使 MOI 介于 0.1~0.5 ，所加的病毒的体积应该是细胞体积的 0.2~1% 。

将摇瓶放回 27 ℃摇床，培养 24 小时。

感染后第 1 天

 

计数细胞，估计细胞大小。如果病毒的实际滴度比估计的高，即 MOI 值高于 0.5 ，你将看到明显的细胞停止生长和肿胀的迹象；反之，如果 MOI 值接近 0.3 或者更低，你将看到细胞几乎没有受到病毒影响，它们的数目扩增到接近 1.2 × 10⁶ 细胞 /ml ，并且看起来健康。这个时候，被感染的细胞应该正在释放病毒至培养液中，去感染其它细胞。

感染后第 2 天

 

再次计数细胞并且估计细胞的大小。此时大多数细胞应该已经被感染。细胞的数目应该远远低于 2.4 × 10⁶ 细胞 /ml （这是在没有病毒感染的情况下细胞正常生长应该达到的密度），并且明显膨胀。

如果细胞的数目在感染后第 0 天和第 1 天之间没有增长，可能是所有的细胞都被同时感染所致，在感染后第二天就可以收获了。如果不是这种情况，将摇瓶放回 27 ℃摇床，培养 24 小时。

感染后第 3 天

 

再次计数细胞，估计细胞大小。如果实验进展与预料一致，此时的细胞数目与第 2 天比应该没有增长。

如果细胞数目在感染后第 1 天和第 2 天之间就已经停止增长，这说明所有的细胞在感染后第 1 天就已经被全部感染，此时可以收获细胞，因为感染时间已经达到 48 小时，这是一般的情况。

如果细胞数目在感染后第 1 天和第 2 天之间仍然有一定增长，并且此时尚未达到平台期，将摇瓶放回 27 ℃摇床，培养 24 小时。

感染后第 4 天

 

再次计数细胞，估计细胞大小。此时最好所有的细胞都被彻底感染、膨胀、生长停止，否则说明用于感染的病毒的量不够，不能在细胞生长达到平台期前使其停止。此时应该收获培养物，离心分离细胞，将培养液避光保存于 4 ℃，或者冻存于 -70 ℃。

通常最好将细胞沉淀冻存。我喜欢的方法是将细胞重悬于小量（比如 1/4 体积）的 PBS 或者 TBS （含有浓度为通常 5 倍的蛋白酶抑制剂）中，充分重悬后直接用微量移液器加入充满液氮的干净 Dewar 瓶中。滴下的重悬物遇到液氮迅速冻结形成小球，这些小球可以被分装到 50ml 圆锥管中，冻存于 Revco 冰箱中。当需要从细胞中纯化蛋白时，只需将这些小球逐个加入到 3~5 倍体积室温下不断搅拌的裂解缓冲液中，它们将很快融化，使缓冲液降至接近 0 ℃。这些小球还可以用镊子方便的转移到 eppendorf 管中作小量实验。