昆虫细胞低MOI杆病毒的感染

感染悬浮细胞是使杆病毒系统生产蛋白的普遍方法。悬浮培养的细胞很容易从10ml扩大到100L。一般来说，悬浮的细胞在无血清的培养液中培养。这种培养液许多公司有售，比如Life Technologies、Hyclone、Biowhitaker、JRH Biosciences、Expression Systems等，用起来都不错，尽管由于细胞株和目的蛋白的不同，效果有所差异。 最好是将目的蛋白和细胞株用不同的培养液做一个表达试验，选出表达效果最好的一种培养液。在进行这个表达试验之前要先使你的细胞株分别适应不同的培养液，否则试验结果不具有代表性。 注意：为了优化表达，你必须了解你的细胞的生长参数；为了方便新手，我将列出一些生长参数通常的值。我最喜欢的Sf9细胞株可以最低以2×105细胞/ml的浓度分装，并且恢复几乎没有滞后期。在对数期，20个小时细胞数目就可以翻倍，浓度最高可以达到5×106细胞/ml。下面的实验步骤将以上面列出的生长参数为前提。如果你的细胞株生长参数有所不同，你需要对实验步骤做出合适的调整。 低MOI感染简介 低MOI（Multiplicity Of Infection，等于用于感染的病毒数目与细胞数目的比值）感染是扩增病毒的最好方法。这有两个原因。一方面，低MOI感染是最快也是最简单的扩增病毒数量的方法；另外，低MOI感染是保存病毒基因的完整性、防止DIP（Defective Interfering Particles，即只包装入部分基因组的病毒颗粒）生成的最好方法。 还可以用低MOI感染的方法生产蛋白，但是难以控制，并且不适于提高蛋白产量。然而病毒需要量少的确是该法的一个优点，对于大规模的生产这个优点极为有利，只要它们可以可靠的复制，这因不同的重组病毒而异。对于小规模的蛋白生产，我更喜欢用高MOI感染。 一般而言，低MOI感染的方法就是先用病毒感染少量细胞，这些被感染的细胞复制出足够的病毒，去感染培养物中剩余的尚未被感染的细胞，而这第二批被感染的细胞就是病毒或者蛋白的主要生产者。 重要的是培养液的量要满足细胞生长的需要，否则将没有足够的营养使细胞生产病毒或者蛋白。另一方面，病毒也不可以太多，以免在细胞增殖到合适密度并用掉所有营养资源之前就被杀死。最理想的是，先确定在没有病毒感染时，细胞保持正常状态所能达到的最大密度，那么如果病毒的量能够使细胞在达到该密度的1/3~2/3时停止扩增是最理想的。我通常是使用该密度的1/2。 采用这个方法需要使用足够的病毒感染细胞，在24~48小时内使细胞停止增长、所有的细胞都被感染。因此，以生长停止作为完全感染的标志，培养物在达到完全感染后可以继续生长大约48小时。如果以生产蛋白为目的，这个过程可能需要更长。 步骤： 将细胞以2~4×105细胞/ml的密度分装到摇瓶中，达到摇瓶体积的20~40%。在27±2℃培养，转速为100~130rpm。 第0天 培养细胞至密度达到4~8×105细胞/ml，即已经进入对数期生长，但是仍处于低浓度。 然后加入少量病毒，病毒量依赖于滴度，但是最好使MOI值介于0.1~0.5。比如，如果你的细胞浓度为6×105细胞/ml，而病毒滴度为3×107pfu/ml，那么要使MOI介于0.1~0.5，所加的病毒的体积应该是细胞体积的0.2~1%。

将摇瓶放回27℃摇床，培养24小时。