杆状病毒-昆虫细胞表达系统

一、杆状病毒表达载体

最简单的经典杆状病毒表达载体是一个重组的杆状病毒，其基因组含有一段外源核酸序列，通常为编码目标蛋白质的dDNA，在多角体蛋白启动子控制下进行转录。这个嵌合的基因由多角体蛋白启动子和外源蛋白编码序列组成，其位于病毒基因组多角体座位，替代了非必需的野生型多角体基因。在实验室中，重组病毒能够感染昆虫细胞或幼虫(毛虫），这会使外源cDNA在感染的极晚期出现高水平的转录。转录出的mRNA经翻译产生目标蛋白质。多角体蛋白启动子似乎总是可以在转录水平上驱动极高水平的外源基因表达，在很多时候可以获得大量的外源蛋白, 就像最初推测杆状病毒能够制造出大量的多角体蛋白那样。确实是这样，具有高水平表达重组蛋白的潜能是杆状病毒-昆虫细胞系统的一个主要优点。在此, 高水平的含义非常宽泛，是指每升感染杆状病毒的昆虫细胞培养物或4 g昆虫细胞(通常细胞密度为 1X106 个细胞/mL)产出大于或等于100 mg的重组蛋白。此外，在杆状病毒-昆虫细胞系统中高水平表达的蛋白质很少形成包涵体，而包涵体常常在细菌表达系统中形成。任何从事重组蛋白生产的研究人员都清楚，在任何表达系统中蛋白质可以达到的产量和可溶水平很大程度上取决于所研究的蛋白质本身。因此, 从25年的杆状病毒-昆虫细胞表达系统使用经验得出的结论是: 与分泌蛋白相比，该表达系统更易获得细胞核蛋白和细胞质蛋白的高表达。前者的表达水平较后者要低, 通常只有每升几毫克到十几毫克 (Jarvis,1997)。

杆状病毒-昆虫细胞系统的另一个优点是具有真核蛋白的加工能力, 包括对蛋白质进行磷酸化或糖基化等的修饰能力。但是，这种观点有一定的局限，现在已经很清楚地认识到，杆状病毒的鱗翅类昆虫细胞宿主的蛋白质加工与更高等的真核细胞不同。另外的困扰是杆状病毒的感染对宿主蛋白质加工有负面的影响（Azzouzetal.,2000;JarvisandSummers，1989)。显然，对于任何有兴趣生产需要进行真核修饰的重组蛋白的研究者来说，特别是已知这种修饰直接或间接的影响功能，这些都是需要重点考虑的因素。

最后指出的是，杆状病毒-昆虫细胞系统已被证明对多蛋白质亚基复合物(multiproteinsubunitcomplexe) 的生产非常有用[参考Berger等 (2004);Kost等（2005) 的综述]。

该系统能够产生由多组分构成的病毒颗粒，这样的病毒颗粒是极好的候选疫苗，这体现了该系统在此重要应用领域的强大功能。例如，杆状病毒-昆虫细胞系统已经用来生产由脊髓灰质炎病毒（poliovirus)、蓝舌病毒（bluetonguevirus)、腺相关病毒（adeno-associatedvirus)、丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus) 和乳头瘤病毒（papillomavirus)来源的多种蛋白质组成的病毒样颗粒。该病毒样颗粒的产生可以通过构建多个表达单一蛋白质的重组病毒来实现，或者构建一个能够编码多个重组蛋白的单一病毒去感染昆虫细胞。

二、杆状病毒表达载体技术一早期

如前所述，利用基本的同源重组原理，构建了第一个重组的杆状病毒载体用于表达由多角体蛋白启动子和外源编码序列组成的嵌合基因。该方法的详细技术可以参考本书的第一版(Bradley,1990), 也可以参考原作者发表的主要论文及其编写的优秀的技术手册(O’reillyetal.，1992;SummersandSmith，1987)。因此，和上面一’样，这部分在此不再赞述。但是，为了对背景有所了解, 对此进行简短地介绍还是很重要的。该常用的方法涉及:

①构建具有嵌合基因的细菌转移质粒，该嵌合基因具有来源于病毒基因组多角体区域的侧翼序列（图I4.1);

②使用转移质粒与从纯化的野生型AcMNPV提取的基因组 DNA 的混合物共转染培养的昆虫细胞（图14.2)。

在共转染的昆虫细胞中，转移质粒与AcMNPV基因组通过同源重组产生重组病毒 DNA 分子，该同源重组发生在转移质粒上的目的嵌合基因侧翼序列与病毒基因组多角体蛋白基因的上游和下游序列之间。为了在敲除(knockout)多角体蛋白基因的同时敲人(knock-in) 编码目标蛋白质的嵌合基因，这必须是一个发生了双交换的重组(doublecrossoverrecombination)。当然，这种重组的发生率相对较低，估计在 0.1% 左右(Smithetal.，1983a)。因此, 必须将少数重组病毒的子代病毒从共转染产生的大量的亲代病毒的子代病毒中分离出来. 通过杆状病毒空斑实验可以很容易地完成分离, 但是研究人员要能够从大量的亲代病毒产生的空斑中辨别出重组病毒形成的空斑。最初，可以通过简单的肉眼筛选来进行辨别, 因为来自亲本的子代病毒形成的为多角体蛋白阳性的空斑, 而重组体子代病毒由于缺少表达多角体蛋白的基因，所以呈现多角体蛋白阴性的空斑。经过专业培训的研究人员能够在解剖显微镜下通过观察实验平板鉴定出多角体蛋白阴性的空斑。因此, 有这种辨别能力是筛选成功的关键。多年来，许多研究人员不具有识别多角体蛋白阴性的杆状病毒空斑的能力，这是一个非常严重的问题，它制约着杆状病毒-昆虫细胞系统作为表达重组蛋白生产工具的应用。

三、杆状病毒表达载体技术—-改进

从1卯0年左右开始，研究人员开始克服了杆状病毒载体分离方面的技术局限，并且通过对上述基本方法的大量改动，在别的方面对该系统也进行了改进。这些改进可以分为两类: 一类是转移质粒的改进; 另一类是亲代杆状病毒基因组的改进。下面对它们分别进行介绍。

四、杆状病毒转移质粒的改进

对转移质粒进行了改进是出于两个不同的目的。最重要的目的是使通过肉眼筛选鉴定重组杆状病毒空斑变得简单，从上面描述的原因可知这曾经很难。通常的一种此类改进方法是引人在杆状病毒启动子控制下的嵌合标记基因。例如，大肠杆菌的/3-半乳糖苷酶蛋白与多角体阴性空斑表型相比，对它的肉眼识别更加容易（Vialardetal.，1990)。

在转移质粒中引人标记基因是聪明的做法，但也应该注意到该种改进方法存在的潜在问题（O’reillyetal.，1992)。弓丨人的标记基因不仅能够作为所需要的双交换同源重组的信号，也能够作为在转移质粒和病毒 DNA之间产生的单交换同源重组(singlecrossoverrecombination) 的信号。单交换重组的发生概率很高，所产生的重组病毒的基因组包含了细菌复制子在内的转移质粒的全部序列，而且整合位点有一定的随机性。这些重组体在遗传上是不稳定的, 新获得的外源基因可能会在 1~2轮的病毒复制中丢失。尽管有很大的局限性, 能将标记基因引入重组病毒基因组的转移质粒还是被广泛使用, 对于那些清楚知道潜在的单交换重组陷阱的研究人员来说, 它们尤其有用。他们只是使用标记基因进行初筛, 然后通过进一步筛选来确定外源基因在基因组中的整合位点，最后确定是否是双交换重组将目的基因转移到了重组杆状病毒载体。

对转移质粒进行改进的第二个目的是方便重组蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统的表达与纯化。这种改进的数量太多因而不能在此逐一讨论, 有3 种通常的改进属于此类，它们包括引人信号肽的编码序列; 在蛋白质的N端或C端引入纯化标签的序列（如His6); 将多角体蛋白启动子替换为别的杆状病毒启动子, 或者使用多个启动子元件替换多角体蛋白启动子，这样就可以在杆状病毒感染时同时表达多个重组体蛋白。

最近的一个出版物列出了几乎所有的经过上述两类改进的杆状病毒转移质粒，并且简短描述了它们功能上的特色，它是该领域一个很好的信息来源（PosseeandKing,2007)。但是，有一类改进并未列出但值得进一步的关注，它们是即刻早期（immediate^early)转移质粒，在这些质粒中，多角体启动子被替换为杆状病毒即刻早期基因的启动子，如AcMNPV的iel基因 (Jarvisetal.，1996)。使用来自杆状病毒早期基因的启动子 (如iel基因)似乎违反之前提及的原则，因为这些启动子比多角体蛋白启动子弱。但是，有一些证据可以表明，在早期启动子控制下重组杆状病毒表达外源基因可以获得更高质量的蛋白质产物，尽管这些早期启动子不能启动同样高水平的转录（ChazenbalkandRapoport,1995；Hill-PerkinsandPossee,1990；Jarvisetal.,1996；Murphyetal.,1990;Rankletal.，1994;SridharetaUW93)。事实上，这个方法尤其适用于分泌蛋白。如上所述，这些蛋白质在多角体蛋白启动子控制下通常是低水平的表达。在这种情况下, 研究人员或许能够利用这种在感染较早期进行外源基因表达的好处, 从而避免杆状病毒感染对宿主蛋白加工途径带来的负面作用，同时也能够获得高水平表达的产物。

五、亲代杆状病毒基因组的改进

就像转移质粒的改进，对亲代杆状病毒基因组的改进也是为了满足各种不同的需要。

起初，最主要的目的是找到克服重组杆状病毒载体构建和分离低效率的方法，这也是最初的杆状病毒-昆虫细胞系统存在的主要问题。现在已经知道这个问题的根源在于, 在共转染的昆虫细胞系中，转移质粒和亲代杆状病毒 DNA 的同源重组效率很低。最终，研究人员想出了一些直接和间接的方法来解决这个难题。

Kitts 和Possee构建出具有线性DNA基因组的杆状病毒，向问题的解决迈出了重要的第一步（Kittsetal.，1990)。这种病毒是通过最初的同源重组方法获得的重组杆状病毒，其主要特点是在多角体蛋白基因座位有一段新的 DNA序列，该序列具有Bw36I的酶切位点(图14.3)。因此, 该基因组能够被5似361线性化并作为亲代病毒 DNA与转移质粒混合后共转染昆虫细胞。这种方法最大的特点是线状的亲代病毒 DNA分子不会复制。因此，线性化在很大程度上减少了共转染昆虫细胞中亲本子代的数量。另外，线状病毒DNA仍然可以与转移质粒进行同源重组，重组后病毒DNA分子重新形成环状结构并恢复复制能力。这些因素加起来，使得共转染的昆虫细胞中重组杆状病毒载体的产生效率从0.1% 增加到10%~20%，也使该技术得到了极大的简化。Kitts和Possee对该方法做了改进，他们构建了一个称为BakPAK6的重组杆状病毒，该病毒可以被Bm36I切开。BakPAK6基因组具有一个位于多角体蛋白基因座位的大肠杆菌^cZ基因，该基因内有一个B361位点，另外还在病毒基因的上游和下游分别引入一个Bsw36I位点(图14.4)。重要的是，经过&M36I的消化，or/1629 的一部分被删除，w/1629是病毒的一个必需基因，它位于多角体基因的下游，编码了病毒核衣壳的鱗蛋白（nucleocapsidphosphoprotein)(VialardandRichardson,1993)。将BakPAK6作为亲代病毒DNA，通过共转染昆虫细胞的方法构建重组杆状病毒载体的效率增加到95%。BakPAK6的成功刺激了多种线性化的杆状病毒DNA的商业化和广泛应用。它们被用做构建重组杆状病毒载体的起始材料。这些商业化的杆状病毒DNA中，最主要的包括ClonTech商业化的原始的 BakPAK6病毒DNA。类似的还有预线性化的称为BaculoGold的病毒DNA(Pharmingen/BDBiosciences)、Novagend的 BacVector、Sigma-Aldrich的 Diamond-Bac。此外，一个称为BaoN-BIue(Invitrogen)的是经过轻微改进的线性化病毒DNA/转移质粒系统, 重组后, 其基因组内的大肠杆菌标志物会得到重建。

在本章的此处，强调这些病毒DNA骨架的发展是很重要的，它们有效地解决了本书第一版出版时在构建杆状病毒表达载体时存在的主要问题。这些线状的杆状病毒DNA被商业公司广泛的市场化并且很快就被生物医学研究机构承认和接受，作为重组杆状病毒构建的改良工具。这些工具和方法 (见下面相关内容)的出现让具有基础分子生物学背景的实验室普通研究人员能够更容易地运用杆状病毒表达载体。最终，杆状病毒-昆虫细胞系统得到了更广泛地应用，并且作为重组蛋白制备的有效工具得到了普遍地认可。

与此同时，Luckow和他的同事们发展了一种与线性化病毒基因组不同的方法来分离杆状病毒载体。他们的方法利用了遗传转座(genetictransposition), 而不是同源重组(LuckowetaL,1993)。该方法通过使用不同的分子机制来产生重组杆状病毒DNA从而使研究人员解决了同源重组的低效问题。该方法的关键在于构建一个新的大肠杆菌菌株, 该菌株具有一个包含完整杆状病毒基因组拷贝的能够自主复制的质粒, 或称杆粒(bacmid)(图14.5)。杆粒的多角体蛋白区域包含大肠杆菌ZacZ基因和mini-AttTn7位点，它是转座的附着位点（attachmentsite)。这株新构建的大肠杆菌菌株还有一个编码转座酶(transposase)的辅助质粒。使用杆状病毒转移质粒转化该新型大肠杆菌菌株，由于转移质粒上的多角体驱动的目标基因的侧翼序列为Tn7附着位点的左端和右端, 该嵌合基因会转座至杆粒上的多角体区域。转座时会导致杆粒上的fccZ基因的删除，这就可以通过在筛选培养基上进行蓝、白斑筛选来鉴别含有重组杆粒的细菌。这样，你就可以从具有白色菌落的大肠杆菌克隆中简便地分离出含有编码目标基因的重组杆粒DNA去转化昆虫细胞。DNA转化会启始病毒的感染并导致子代重组杆状病毒的产生。这种体内转座法可以以100% 的效率产生重组杆状病毒DNA。它的商业化产品最初称为Bac-toBac系统，由LifeTechnologies 公司开发，而现在可以从Invitrogen公司购买。Bac-toBac系统以细菌为中心的特点是很重要的，因为它可以让不熟悉病毒学而更熟悉细菌学和分子生物学的研究人员仍然在自己熟悉的领域工作。但是，该系统存在的一个不足是重组杆状病毒保留了细菌的复制子，与不含有该结构的病毒相比，它使杆粒在昆虫细胞中传代时具有高度的遗传不稳定性[Pijlman等(2003) 及见下文]。

近期,Possee和King的研究小组提出了一种更为聪明的想法，该方法是线性化杆状病毒DNA法和杆粒法的交叉杂合（P0sseeetal.，2008)。从本质上讲，他们构建了一个新型的具有重组杆状病毒基因组的杆粒，该基因组在多角体座位有一个细菌的复制子(replicon)且缺失了下游的烈基因（图14.6)。由于存在细菌复制子及缺失了基因，这个杆粒可以在大肠杆菌中复制, 但是不能在昆虫细胞中复制。因此，可以使用携带有这种杆粒的大肠杆菌方便地制备用于构建重组子代病毒载体的亲代杆状病毒基因组 DNA。你可以简单地从大肠杆菌中分离出病毒DNA，与转移质粒混合后共转染昆虫细胞。在病毒与转移质粒DNA之间的同源重组会同时恢复#/2629，在多角体蛋白基因座敲除细菌复制子并且在相同位置插入目标基因。尽管这种方法没有提高同源重组的效率，但是明显提高了在共转染的昆虫细胞中产生重组杆状病毒的效率，因为亲代病毒DNA 是有缺陷的，不能自我复制。该方法已经由oxfordExpressionTechnologies进行了商业化，产品为flashBAC。flashBAC系统有一个值得再次强调的特点，如上所示, 细菌的复制子在同源重组中被剔除。这样做的优点在于消除了用常规杆粒(保留有细菌的复制子)制备杆状病毒载体时的遗传稳定性问题(Pijlmanetal.，2003)。另一个值得再次强调的特点是在flashBAC系统中使用的杆粒包含了在昆虫细胞中不能复制的缺陷型杆状病毒基因组。显然，这就意味着在该系统中，需要亲代缺陷型病毒基因组与转移质粒之间的同源重组来形成不需要辅助的子代杆状病毒。但是，这并不一定意味着共转染的昆虫细胞将只能产生重组的子代杆状病毒。由于遗传互补作用（geneticcomplementation)，这些细胞也能够产生源于缺陷型亲代病毒基因组的子代病毒。特别的是，在共转染的昆虫细胞中产生的重组病毒能够提供的产物，它为缺陷型病毒DNA的顺式装配提供了辅助功能。使用flashBAC系统制备杆状病毒时至少要进行一轮空斑纯化，然而OxfordExpressionSystems的商业文献指出这是不必要的。不进行空斑纯化，通过共转染昆虫细胞获得的原始重组病毒将会污染有缺陷型的亲代病毒, 它们会干扰接下来的载体复制与外源基因的表达。

制备杆状病毒载体最简单的途径可能是使用一种交叉杂合了Gateway技术与线性化亲代病毒DNA技术的方法（Hartley,2003;WalhoutetaL,2000)。该方法涉及编码目标蛋白质的Gateway进入质粒(entryplasmid)以及线状的亲代病毒DNA在体外而不是体内的重组。在这个系统中, 亲代病毒DNA以线状的形式存在，其基因组中的多角体蛋白编码序列被大肠杆菌LacZ基因和单纯痕瘆病毒(herpessimplexvirus)胸苷激酶(thymidinekinase)基因替换，替换序列的两侧有噬菌体1的位点特异性重组位点（attRl 和 attR2; 图M.7)(site~specificrecombinationsite)。含有LacZ基因的病毒呈现出蓝色空斑，在添加有某种核苷类似物（nucleosideanalog)，如丙氧鸟苷（gancyclovir)的昆虫细胞中培养，胸苷激酶基因提供了针对亲代病毒DNA的阴性选择标记。将线性化的病毒DNA与编码目标蛋白质的 DNA进人质粒混合，目标蛋白质编码序列的侧翼序列为A噬菌体的位点特异性重组序列（attLl和attL2)，在混合物中加人纯的重组酶^沈。!^!^-nase)(LRClonase;Invitrogen), 该酶会介导进人质粒和亲代病毒上att位点间的位点特异性重组。需要重点指出的是, 该体外反应是一种非定量意义上的高效重组反应，其产物为亲代杆状病毒DNA与重组杆状病毒DNA的混合物。随后，该混合物通过转染进人昆虫细胞，像前面指出的那样，在含有丙氧鸟苷的培养基中培养，丙氧鸟苷能够阻止亲代病毒的复制。经过一轮筛选，子代重组杆状病毒载体的数目得到增加，通过空斑形成实验可以从相对较低水平的子代杆状病毒背景中将其检出。在，半乳糖苷酶显色底物存在的情况下，重组体的空斑表型为白色，可以依此很容易地将其鉴定出来。这种在体外获得重组杆状病毒载体的方法，最初是由Franke与他的同事在LifeTechnologies研发出来的。

然后由Harwood和他的同事在Invitrogen将其商品化为BaculoDirect系统。该系统使用起来非常地快速、有效和简单。但是，需要着重指出，与flashBAC系统类似,BaculoDirect系统在市场上被宣传为「无需空斑纯化或细菌中的筛选，即可从杆状病毒克隆与表达基因」，就像前面指出的那样，这不是好的建议，尽管胸苷激酶基因产物和丙氧鸟苷的存在会对亲代病毒产生一个负向选择压力，但用体外重组产物转染的昆虫细胞仍然既会产生重组体子代又会产生亲代病毒的子代。因此，研究人员在使用BaculoDirect系统时不要轻信厂商宣称的内容，相反应进行至少一轮的空斑纯化将具有目标基因的重组杆状病毒从亲代病毒污染中分离出来。事实上, 那些接受了该建议并且使用了含有，半乳糖苷酶的琼脂层进行空斑纯化的研究人员通常至少会看到一些蓝色的斑点，这显示亲代病毒的存在并肯定了对重组杆状病毒的空斑纯化是明智的决定。公平地说，商业化的BaculoDirect系统的操作手册(Invitrogen)包括了在含有/■半乳糖苷酶的培养基上进行空斑纯化的方法，这提供了很大的便利。

在了解了上述体外重组方法的基础上，还应对一些已经公开出版的直接体外重组DNA法进行简短的介绍。这些方法涉及对改进后的杆状病毒基因组进行消化及其后与外源DNA片段的直接连接。这些方法的一个实例涉及在AcMNPV基因组上多角体蛋白启动子下游引入两个&m36I位点（LuandMiller,1996)。这两个位点的识别序列有着微小的差异。经&w36I位点消化后产生5’-TTA^的单链突出序列（singlestranded5’-TTA-3’overhangingsequence)，该序列可以在dTTP存在下被大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段转化为 5~TT-3’的单链突出。这就产生了一个线性的杆状病毒DNA分子，任何DNA片段都可以与其进行连接，只要它经过Ec0RI酶切后产生y-AATT-3’的单链突出，然后再经Klenow片段和dATP处理为V-AAW的单链突出。这种改进的主要目的在于给以杆状病毒为基础的cDNA表达库的构建提供方便。其他两个直接体外重组的实例都涉及在杆状病毒基因组中引人归巢内切核酸酶（homingendonuclease)的酶切位点。其中一个是在AcMNFV基因组中引入一个I-Sce-I位点来构建一个命名为Ac-Omega的重组体（Ernstetal.，1994)。分离自该病毒的基因组DNA可以被I-Sce-I消化后与被同样的酶处理过的DNA片段连接。另外一个被命名为Homingbac系统，它涉及在许多不同的杆状病毒基因组中引入一个单一的I-Cew-I位点（Lihoradovaetal.，2007)。从这些病毒中分离的基因组DNA被I-Cew-I线性化后可与用BsfXI处理后具有可匹配突出末端的DNA片段连接。目前，本段描述的3种直接克隆的载体都没有实现商品化，在文献报道中该方法也应用得不多。因此，很难对这几种直接克隆方法是否相对成功或者其杆状病毒骨架能否广泛用于制备杆状病毒表达载体作出评估。

除解决关于重组杆状病毒载体构建的早期技术难题外，一些对亲代杆状病毒基因组进行改进的目的是增强重组载体上外源蛋白的表达。基本的做法是删除这样的一些杆状病毒的基因:①已知这些基因对病毒在培养的昆虫细胞中的复制是不需要，暂且定义为「附属」(accesSory)基因;②认为这些基因通过某些方式干扰了外源蛋白的产生或降解目标蛋白质。此类杆状病毒DNA是最初由Bishop和同事们研发出的线状病毒DNA，后来被Novagen商品化为BacVector-2000。除多角体蛋白外，这种病毒DNA还缺少其他5种未公开的附属基因。缺失这些基因对于外源蛋白产量的影响一直都不清楚，因为没有相关报道用这些基因缺失与否的杆状病毒DNA进行外源蛋白表达量的对比研究。

接着, 另外两个非必需基因: 一个编码几丁质酶（Hawtinetd.，1995), 另一个编码组织蛋白酶样蛋白酶(cathepsin-likeprotease)(Slacketal.，1995) 在BacVector-2000被剔除，所形成的以AcMNPV为基础的亲代病毒DNA被称为BacVector-3000(Nova-gen)。其他的以AcMNPV为基础并缺失了病毒几丁质酶和组织蛋白酶样蛋白酶基因的病毒包括一种被称为BestBac(表达系统)的商业化的杆粒和一种未商业化的称为八出扣-DCC(Kabaetal.，2004)的经修饰的杆粒。flashBACtm系统中使用的杆粒同样缺少有功能的几丁质基因。亲代病毒上几丁质酶和组织蛋白酶样蛋白酶的缺失对重组杆状病毒载体的子代病毒的外源基因表达的影响并不是完全清楚，但还是有一些资料可以参考。

其中一项研究表明，缺失这两种酶的AcBacDCC表达的一个外源糖蛋白比含有这两种酶的杆状病毒载体表达的糖蛋白更不容易降解(Kabaetal.，2004)。这似乎与预期是一致的，删除病毒蛋白酶基因通常会促进重组蛋白和分泌蛋白更好地表达。但是, 还需要做更多的工作来确定剔除某个特定的蛋白酶基因是否会广泛的影响外源蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的生产。目前还比较少观察到删除病毒几丁质酶基因的潜在影响。曾有研究显示, 病毒几丁质酶驻留在内质网上，它通过饱和宿主蛋白转运机器来干扰分泌途径蛋白的产生(Kabaetal.,2004)。如果上述机制是事实, 那么删除病毒几丁质酶基因从而达到没有几丁质酶的目的, 这样可能会增加分泌蛋白的表达水平。但是，目前还没有公开出版的研究证明单独删除以AcMNPV为基础的载体, 如flashBAC上的几丁质酶基因所产生的影响。研究显示，缺失了几丁质酶的AcBacDCC表达的外源蛋白降解减少, 但该病毒同时缺失了组织蛋白酶样蛋白酶，这使得结果的解释变得复杂化。另外，已有一篇出版的文献显示单独或全部剔除重组丝虫杆状病毒(recombinantsilkwormbaculovirus)的几丁质酶或组织蛋白酶样蛋白酶基因对外源蛋白生产的影响[家蚕核型多角体病毒Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,(BmNPV)，Leeetal.，2006]。在这个系统中，编码昆虫纤维素酶(Cellulase)的重组BmNPV载体在删除几丁质酶或组织蛋白酶样蛋白酶基因时在蚕中表达的外源蛋白具有更高的水平和更好的酶活性。而且，用缺失这两种病毒酶基因的载体可以获得具有最高酶活性、最高表达量的纤维素酶。你会推测这些结果显示从AcMNPV为基础的载体删除病毒几丁质酶基因会有类似的效果。但是，由于在这个研究中是以蚕（silkworm)而不是以昆虫细胞系作为宿主, 这种推测的合理性会被削弱。

DiamondBac是另一个通过删除非必要基因在杆状病毒-昆虫细胞系统中增强重组蛋白表达量的亲代杆状病毒DNA的例子。如上所述，DiamondBac是与BakPAK6类似的商业化的、预先线性化的杆状病毒DNA，但是这种病毒DNA还缺少有功能的WO基因，有研究显示，该基因与宿主细胞的裂解有关（WilliamsetaL，1989)。因此，制造商的商业文献指出，用该亲代病毒产生的重组杆状病毒载体感染的细胞会在感染过程中一直保持较高的细胞活性，这会有助于提高重组蛋白的表达水平（Sigma-Aldrich,2008)。

DmmondBac的另一个让人感兴趣并有潜在用途的特点是，在杆状病毒基因组中的W0基因被蛋白二硫化物异构酶（proteindisulfideisomerase，PDI)基因替代，该基因编码的一种伴侣蛋白能够促进二硫键的形成并有助于蛋白质的折叠。已有公开出版的证据表明，在杆状病毒-昆虫细胞系统中共表达PDI, 可以提高重组IgG的可溶性和分泌水平(Hsuetal.，1996)。Sigma-Aldrich的商业文献指出，WO基因的缺失以及PD7基因的插入可以将多数重组蛋白的总产量提高接近10 倍。但是，没有公开发表的研究对重组杆状病毒载体有无WO基因缺失或PDI基因插入情况下外源蛋白的生产水平进行比较。

因此，在最终的分析中, 为了直接确定非必须病毒基因，如病毒的几丁质酶基因、组织蛋白酶样蛋白酶基因和朽o基因的缺失对在杆状病毒-昆虫细胞系统中进行蛋白质生产的总体影响, 需要对合适匹配的AcMNPV来源的载体进行直接比较研究。

除了DiamondBac亲代杆状病毒DNA外, 已有文献报道有人设计出插入了编码外源蛋白加工酶基因的杆状病毒载体，以此来提高外源蛋白的产量。这之中就有一个重组杆状病毒载体具有在P]0启动子控制下的多分 DNA 病毒(polydnavirus)wai^yri77基因(Fath-Goodinetal.，2006)。已经发现某些基因的表达产物可以延长被杆状病毒转染的 Sf9 细胞存活时间，这相应的就能够提高在多角体蛋白启动子控制下共表达的外源蛋白的产量。其他可以归为此类的杆状病毒载体包括具有在杆状病毒id启动子调控下的外源糖基转移酶（glycosyltransferase)基因（Jarvisetal.，2001;Tomiyaetal.，2003)或与磷酸胞苷唾液酸（CMP-sialicacid)生物合成相关的酶的基因（Hilletal.，2006)的载体。在载体中使用早期启动子, 可以在感染的早期表达这些具有加工功能的蛋白质，使其表达远远早于外源蛋白的表达。这就使得昆虫细胞的内源性N-糖基化功能得到延伸，在目标糖蛋白开始表达之前就具有了对蛋白质进行人源糖基化的能力。

一种转移质粒可以同时将多分 DNA 病毒基因和外源蛋白的基因引入到杆状病毒基因组中，Paratechs已将这种质粒商品化。类似的，在不久的将来，具有更高级真核iV-糖基化功能的亲代杆状病毒DNA会被商业化并用于制备重组杆状病毒。这些重组杆状病毒的出现会使对这些类型的病毒载体增加蛋白质表达水平的能力或生产人源化糖蛋白的能力进行全面评估变得更加方便。目前, 未曾使用大量的外源蛋白/糖蛋白对这两方面的能力进行过评估。

六、杆状病毒-昆虫细胞系统的另一半

考虑到目前为止本章的重点都放在了杆状病毒表达载体上，很有必要提醒读者，杆状病毒-昆虫细胞系统是一个由两个部分组成的二元系统。当然，第一个部分就是杆状病毒表达载体，它是一个昆虫病毒，其功能显然就是将编码目标蛋白质的外源基因导人宿主细胞中。杆状病毒表达载体的另一个功能是为在晚期或极晚期启动子控制下的目标基因的转录提供所需的转录复合物。第二个部分就是到目前为止几乎没有提及的宿主，通常是鳞翅类昆虫细胞系，但有时是鳞翅类的昆虫。

鳞翅目昆虫(OrderLepidoptera)包括蛾(moth)和蝴蝶（butterfly)，它们是杆状病毒家族中多种病毒(包括AcMNPV)的宿主。Grace在1%2年第一个建立了鳞翅类昆虫细胞系(Grace,1962)。至今，已经建立了超过250种昆虫细胞系（Lynn,2007)。但是, 我们重点关注两个杆状病毒表达载体最常用的鳞翅类昆虫细胞系。其中一个是Sf9, 由Smith和 Summers在1987年亚克隆IPLB-SF-21而建立的，IPLB~SF-21细胞系是在1977年从草地贪夜蛾(Spodo卿ra/rwgipenia, 又称为秋天行军虫）的卵巢组织中分离出来的 Sf9 细胞可以在很多商业公司购买到，如Invitrogen和Novagen或者美国模式菌种收集中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC)。另外一种是HighFive, 最初是从粉纹夜蛾m’，又称为甘蓝银纹夜蛾(cabbageIooper)]的成熟卵巢组织中分离到的细胞系，在1992年由Granados和Wood的小组称为BTITn5B-1，后被Invitrogen商业化为HighFive。

Sf9和HighFive两种细胞系的一个有趣的特点是二者都能够以贴壁或悬浮状态生长。由于这个特点，通过感染数以百万计的在培养板或培养瓶中生长的 Sft或 HighFive细胞，可以很方便地进行实验室规模的蛋白质生产实验。贴壁生长的 Sf21或Sf9 细胞也常规用于空斑筛选和重组杆状病毒表达载体的定量。另外，Sf9和HighFive两种细胞都能够在转瓶（spinnerflask)、摇瓶（shakeflask)、气升式搅拌槽（airlift,stirredtank)、Wave生物反应器(Wavebioreactor) 中扩大规模来生产大量的重组蛋白。

昆虫细胞培养的条件和方法与大多数研究人员所熟悉的哺乳动物细胞的培养方法大不相同。例如，培养昆虫细胞的最适温度是28°C而不是37°C另外，Sft和HighFive

细胞贴壁不紧, 在传代培养时不需要EDTA或胰酶(trypsin)处理。昆虫细胞的生长不需要含有CO2的培养箱，因为昆虫细胞培养基是用磷酸盐作为缓冲液而不是碳酸盐。Sf9和HighFive细胞都可以在有或没有血清的培养基中生长, 这两种培养基的来源都很广。事实上, 从1990年本书的第一版面世以来, 多种不同的昆虫细胞培养基都能够从多个不同的制造商那里买到，其中最主要的包括ExpressionSystems、Invitrogen(GIB-CO)、HyClone和Sigma-Aldrich。但是，需要指出的重要一点是，Sf9和HighFive细胞会倾向于逐渐适应某种特定的培养基。因此, 突然地将Sft和HighFive细胞的培养基由有血清培养基变换为无血清培养基会导致培养细胞的损失。一个更容易成功的做法是缓慢戒除血清法。例如，在连续的4次传代中，你可以将无血清培养基的比例从0% 依次升高至25%、50%、75%，直至100%。即使使用这种相对缓慢的血清戒除法，当将细胞刚刚置于不含血清的培养基时，这些细胞也会经历短暂的生长停止或生长缓慢。因此, 保持耐心非常重要，因为这些细胞会在新培养基中迟滞生长12天后恢复正常的生长速率。

缓慢血清戒除法不仅对从有血清培养基到无血清培养基的转换有用，还可以用于将昆虫细胞从一种无血清培养基转移到另一种无血清培养基。

七、杆状病毒表达载体的新一代昆虫细胞宿主

最早的鳞翅类昆虫细胞的遗传转化技术出现在1990年（Jarvisetal.，1990)。那时，研发该技术的初衷在于构建一个稳定转化的昆虫细胞系，它旨在能够持续生产目标重组蛋白而无需使用杆状病毒进行感染。然而, 构建这个生产用细胞系所用的载体及方法也为构建具有新型特色的转基因昆虫细胞系提供了条件，这些新型细胞系将能够更好地支持重组杆状病毒介导的外源蛋白的生产。第一个进行宿主细胞改造的案例是要解决本章前面提出的一个问题, 即杆状病毒-昆虫细胞系统能够进行真核蛋白加工，但这种加工与更高等真核细胞对蛋白质的加工并不总是相同。对于这个局限，大家了解最多的一个例子是Sft和HighFHve细胞都能够对新合成蛋白质进行N-糖基化, 但其对JV连接的糖链(〗V-聚糖)[参考Harrison和Jarvis(2006;2007b),Shi和Jarvis(2007)的综述]的加工却达不到哺乳动物细胞那样的程度。第一个从改造细胞的角度来解决这个问题的方法是使用在AcMNPVid启动子调控下的牛/M，4-半乳糖基转移酶（bovine片1，4-galactosyltransferase)cDNA转化Sf9 细胞（Hollisteretal.，1998)。该cDNA编码Sf9 细胞中没有的N-聚糖加工酶，导人该酶的目的是使Sf9 细胞的内源蛋白加工能力得到扩充，这样转基因细胞系生产的iV■糖基化糖蛋白的JV-聚糖就可以经过进一步的加工，更接近于人源iV-聚糖。确实，最终得到的命名为S_GalT的细胞系具有该酶的编码序列，并能够组成型表达这个哺乳动物基因，这使它具有了亲代细胞系不具备的能力: 生产具有部分人源 N-聚糖结构的外源糖蛋白。但这仅仅是对细胞进行改造的第一步，因为需要对Sf9 细胞蛋白质N-糖基化途径进行进一步的人源化，而这需要「敲人」更多的其他哺乳动物功能基因。总的来说, 可以通过构建W启动子驱动下的编码其他功能的哺乳动物基因，然后用其生成另外的转基因 Sf9 细胞亚克隆来完成这个任务（Aumilleretal.，2003;HollisterandJarvis，2001;Hollisteretal.,2002;Seoetal.,2001)。所构建的每个细胞系都能够支持杆状病毒的复制和杆状病毒介导的外源基因表达，同时也能够组成型地表达所转入的哺乳动物基因。最终，每一个这种转基因的昆虫细胞系较其亲代Sf9 细胞具有更深入的N-聚糖加工能力，能够产生具有更接近人源JV-聚糖糖基的糖蛋白。HighFive细胞也有类似的转基因细胞系，它们转入了在id启动子控制下的两种不同的哺乳动物糖苷转移酶的基因（BreitbachandJarvis,2001)。Invkrogen已经将一个最初命名为SfSWT-I的源于 Sf9细胞的转基因昆虫细胞系商业化，其商业名为MIMIC, 该细胞系具有更深入的N-糖基化途径，在含有血清的培养基中生长时能够表达出人源化的重组糖蛋白。在不久的将来，具有很多哺乳动物基因的更髙级的昆虫细胞系会被商业化，这样的细胞系能够在不含血清的培养基中生产具有唾液酸化末端糖基的糖蛋白（Aumilleretal.>2003)。另有一种很有希望作为改进的杆状病毒表达载体宿主细胞的转基因鳞翅类昆虫细胞系衍生于 Sf9细胞，它转人了立即早期杆状病毒启动子控制下的多分DNA病毒 Wznbrin 基因(Fath-Goodinetal.,2006)。就像上面讨论的那样，杆状病毒介导的多分DNA病毒 mMyhn 基因的表达可以使杆状病毒感染的Sf9细胞活的更长，从而增加了在多角体蛋白启动子控制下的共表达的外源蛋白的产量。同样的道理，一个经过工程改造能够组成型表达基因的转基因Sft 细胞系具有更长的寿命，感染携带黄色荧光蛋白基因的重组杆状病毒后能够以更高水平表达黄色荧光蛋白（Fath-Goodinetal.,2006)。ParaTechs公司已经将 3种不同的衍生于 vankyrin-enhanced(VE)Sf9的细胞系进行了商品化。

目前已经有了 MIMIC 和 VE 细胞系, 将来会出现别的同样类型的转基因昆虫细胞系，它们的出现能够允许研究人员对这些细胞系生产人源化糖蛋白的能力和提高重组蛋白表达水平的能力进行更加全面的分析。这样的分析很重要，因为这两种类型的经过改进的杆状病毒表达载体的宿主都没有使用大量的不同外源蛋白 Z 糖蛋白对其进行广泛的评估。事实上，已有关于 MIMIC(SfSWT-I) 细胞不能够将一种特别的外源糖蛋白，马的黄体生长激素/域毛膜促性腺激素（equinelutenizinghormone/chorionicgondotropin)(LegardinieretaL，2005) 唾液酸化的报道。这两种马的糖肽类激素是由相同的基因编码的，因而有相同的氨基酸序列。根据对天然产物（Smithetal.，1993)N-连接糖蛋白特征的分析，你会预期 MIMIC(SfSWT-l) 细胞产生的重组激素在末端有 a2,3-连接的唾液酸残基。因此，:Legardmier 与他的同事获得的结果很可能反映了 MIMIC(SfSWT-1) 细胞不能对马的促黄体生长激素/绒毛膜促性腺激素进行 a2，3-连接形式的唾液酸化，之前从未对该细胞的这种能力做过评价。事实上，最近我们发现, 尽管 MIMIC(SfSWT-1) 细胞编码并表达鼠的 a2,3-唾液酸转移酶 U2，3-sialyltransferase), 但却未检测出细胞中有该酶的活性 (数据未给出）。现在清楚了 MIMIC(SfSWT-l) 细胞不具有对所有目标外源N-糖基化蛋白进行唾液酸化的能力。研究人员正在尝试构建新的细胞系，它可以进行 a2,6-和a2,3-唾液酸化。但是，一种具有 a2,3-唾液酸转移酶活性的新转基因昆虫细胞系也有可能不能唾液酸化所有的目标糖蛋白。而且，如果在 VE 细胞和其他的作为杆状病毒表达载体改进的宿主的转基因细胞系中都出现这种局限, 不要感到惊讶。

八、杆状病毒的基本操作方案

本书第一版的第 10 章中就已经包含了许多重要的关于杆状病毒转移质粒构建、昆虫细胞培养、杆状病毒表达载体的生产、分离和鉴定的较为详细的操作方案，还有在杆状病毒-昆虫细胞培养体系中表达重组蛋白所需的分析方法 (Bradley,1990), 这些至今仍然可以使用。此外，也相继出版了大量有关杆状病毒-昆虫细胞培养体系的书籍，这些书籍或其章节都有详细的技术方案（KingandPossee,1992;Murhammer，2007;O’reillyetal.，1992;Richardson，1995;SummersandSmith，1987)。最后指出，对于本章中提到的那些为便于制备和分离重组杆状病毒表达载体而构建的新型杆状病毒转移质粒和杆状病毒基因组骨架，每个构建者都提供了详细的图谱、序列和使用所需的分步操作方案，这些都可以从他们的网站免费得到。相应地，我也选择了一些在我们实验室使用的, 相对小型的，但都是必须的一套经过数次检验的技术方案和大家分享, 这些技术方案来源于 Summers和Smith(1987)及 O7ReiUy 等(19)编写的杆状病毒使用者「手册」，但在某些部分，根据我们的需要进行了适当地改良。对于本章提到的任何具体方法，转移质粒和亲代杆状病毒载体，读者可以参考下面给出的来源去获取有关的直接详细信息, 此处就不再进行复述了。

昆虫细胞的培养

我们通常在125 mL 的DeLong 摇瓶（Bellco) 中培养 50 mL 的Sf9细胞培养物，不论使用有血清或无血清培养基。对于有血清培养, 我们使用添加了 10%(V/V) 胎牛血清 (HyClone)和 01% 聚醚 F68(pluronicF68)(Sigma-Aldrich)的 TNM-FH 培养基；对于无血清培养，我们使用 ESF921(表达系统）。在我们的细胞培养中，我们既不将胎牛血清进行热灭活，也不在培养基中添加抗生素，因为使用我们的标准共挑选方法(standardcoselectionapproach) 进行转基因亚克隆的构建时，它们会产生干扰（HarrisonandJarvis，2007a;JarvisandGuarino,1995)。在每周的周一、周三和周五, 我们将培养的细胞传代，在周一和周三，Sf9细胞的接种密度为 0.5X106 个细胞/mL, 在周五为 0.3X106 个细胞/mL。使用标准的台盼蓝染色排除法在血细胞计数器上检测细胞密度（Murhammer,2007)。在摇瓶培养中 Sf9细胞的活力应维持在较高的水平，其倍增时间应在 24 h 左右。

对于更大量的细胞, 其培养可进行如下放大:100 mL 的细胞在 250 mL 的DeLong 摇瓶中进行培养，200 mL 的细胞在 500 mL 的DeLong 摇瓶中，或者 800 mL 的细胞在 2.8L 的 Fembach 瓶子(Bellc0) 中培养。转基因的昆虫细胞系的接种密度各有不同，通常均高于Sf9细胞的接种密度。在我们最近的实践中，以与 Sf9细胞相同的接种密度接种转基因的昆虫细胞系，它们的生长会变慢并且/或者经历一个暂时的停滞，之后再开始以正常速率生长。

杆状病毒基因组DNA的分离

除非你可以一直购买商业来源的已经纯化过的病毒DNA，因为分离出足够纯度的杆状病毒基因组DNA是制备重组杆状病毒表达载体的一个重要方面。采用差速离心方法，我们可以从芽生病毒(buddedvirus)中分离出病毒DNA。使用合适的亲代病毒感染 S9细胞，为避免缺失性干扰粒子（defectiveinterferingparticle)的产生（Kooletal.，i9；n)，应使用较低的感染复数 (如 o.Oi 空斑形成单位/细胞）。如上所述，采用加有胎牛血清和普朗尼克(pluronic)F68 的 TNM-FH 培养基培养细胞 3~5 天，并在相差显微镜下监控细胞的病理学征兆。一旦观察到明显的感染迹象，立即将感染的细胞在无菌的条件下转移到一次性使用的离心管中，大约 1000ul 离心 15 min。将澄清的上清液转移到超速离心管（如 33 mL 的BeckmanSW28 离心管）中，之后将含有 5 mmol/LNaCl和 10 mmoI/LEDTA的 25%(m/V) 蔗糖溶液小心地加入离心管底部 (如 3 mL 的BeckmanSW28 离心管）。再将离心管以 4°C, 大约 100000 g 离心 75 min(如对于 BeckmanSW28 转子，可采用 28000r/min)，之后，将上清液倾出，留下芽生病毒的沉淀块。使用蓝色枪头 (剪掉尖端，以具有较大的口径) 加入一定量的裂解缓冲液 (每毫升的初始感染性病毒培养基中加入 0~ImL) 温和重悬病毒沉淀，裂解缓冲液的组成为 10 mmol/L Tris(pH7.6)、10 mmol/L EDTA 和 0.25%(m.V)SDS。然后向其中加人蛋白酶 K(10 mg/mL, 溶于水）至终浓度为500jug/mL, 将其置于 37°C 孵育，间或旋转，直至溶液变得澄清, 这个过程通常需要 4 h 到一整夜。如果溶液仍是比较浑浊的, 那么应加入更多的裂解缓冲液和蛋白酶 K。将所得溶液依次釆用苯酚和苯酸-氯仿进行温和的抽提，之后，在0.3mol/L 乙酸钠存在下通过乙醇沉淀病毒DNA。最后, 使用 TE 重悬 DNA 沉淀 (相对每毫升的初始培养物加入 10fxL 的 Tris-EDTA 缓冲液进行重悬)。重悬的病毒DNA 浓度可采用分光光度计进行估测，但是，我们发现其非常不可靠。所以，我们一般通过对比法来使该估值更精确: 使用 Ec0RI 或Hhdin 消化 10 的病毒DNA，然后将消化产物与已知浓度的商业化 DNA分子质量标准进行琼脂糖凝胶电泳，接着以溴化乙锭或其他 DNa 染色方法染色。应该注意的是，这种方案与 o，Reilly 与其同事（O’reillyetal.，1992)在杆状病毒表达载体使用手册中所描述的方案在本质上是一样。

杆状病毒的空斑分析

总的来说，空斑分析是病毒学的一个重要方面。它是确保重组病毒以单一克隆形式被分离出来的最佳方法。进行空斑分析的准备工作包括两个互相独立的步骤:①在培养皿中预接种指示细胞;②将病毒储存液进行一系列的 10 倍梯度稀释。如上所述, 我们使用在摇瓶中培养的处于对数期生长期的S9细胞进行接种, 该细胞的生长培养基为含有 10% 胎牛血清和 0.1% 普朗尼克 F68 的 TNM-FH。将所需数目的细胞温和离心后丢弃旧的培养基，然后使用新鲜的无添加物的 TNM-FH 重悬细胞, 最后将细胞以 0.75XIO6个细胞/孔的密度接种于 6 孔细胞培养板 (corning)。在 28°C 下 I 障育 Ih 以使细胞沉降并贴附于培养板的塑料内壁。相对于培养基中有血清时，培养基中无血清时细胞会更加紧密地附着于培养板。在细胞进行贴壁时，可以将病毒储备液进行一系列的 10 倍梯度稀释，该稀释建立在一个假设之上，即病毒储备液具有的噬斑实验滴度为IXlO7pfu/mL。

我们采用含有胎牛血清和普朗尼克 F68 的 TNM-FH 作为稀释液，0.ImL 的病毒液加人 9.9 mL 的稀释液后为 100 倍的稀释,0.5 mL 的病毒液加入 4.5 mL 的稀释液后为 10倍的稀释。设置好空白稀释液后在无菌的条件下进行稀释，每次转移溶液后采用涡旋混合器混匀。在完成稀释和细胞已经贴附于培养板后进行细胞接种，每个稀释度接种两个细胞孔。将细胞孔中的培养基移除后每孔加入 2 mL 的病毒稀释液。这是该实验中的关键步骤，因为细胞会很快干掉，如操作太慢, 培养皿边缘的细胞将会死亡。所以，每次最好只移除两个孔的培养基，并立即加人相同浓度的病毒稀释液，然后，再进行下一对细胞孔和下一个稀释浓度的操作。我们一般采用 10_5、10—6 和 10_7 的病毒稀释度进行感染，以便于得到合理数目的空斑用于计数。再将病毒与细胞置于 28°C 孵育 Ih 以使病毒吸附于细胞，这期间应同时制备覆盖培养基 (overlaymedium)。我们准备了一个 125 mL 的瓶子，瓶子装有 50 mL2%(m/V)的溶于水的Seaplaque 低熔点琼脂糖 (Cambrex), 将该瓶进行高压灭菌, 随后使琼脂糖凝固。所得的瓶装固态琼脂糖可以采用微波处理使其再次融化, 之后冷却到大约 60°C 与等体积的已经预热到 30°C 的 2XGrace、培养基 (每孔需要 3 mL) 混合。如果使用蓝、白斑筛选来帮助鉴定假定的重组病毒，那么，此时应将显色底物加入覆盖培养基中。接着将覆盖培养基进行涡旋混合以获得均匀的混合物，再冷却至 40~42°C。最后，将感染的细胞从孵育箱取出，使用移液管彻底吸出病毒接种物，并将 3 mL 的覆盖培养基从孔的边缘缓慢地加人到培养孔。同样的，每次先吸出 2 个孔的病毒接种物，再相应加人覆盖培养基，之后进行下一组的操作，避免细胞脱水和死亡。放置 15 min 以使覆盖培养基变硬, 将培养皿置于封闭的塑料袋中，颠倒后于 28°C 孵育 7~10 天。使用解剖显微镜观察空斑并仔细计数, 使用所得的空斑数、稀释倍数及感染体积来计算原始病毒储存液的滴度。