昆虫杆状病毒表达系统的研究进展

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体外基因表达

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工 、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。

1、杆状病毒的生物学特性

杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。

核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：

①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。

②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。

昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。

近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳 的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。

AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。

前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白。

多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％ ，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用。可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。

2、杆状病毒基因组的结构和功能研究

杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。

目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角体病毒(BmNPV) 、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV) 、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)。

目前AcMNPV基因组的研究最为深入，它是双链超螺旋大分子环状DNA，其大小为90～160kb，约编码154个基因。AcMNPV基因组的基因组织(gene organization)较为复杂，基因组的不同区域具有功能分化，基因的分布尚无规律可循，但AcMNPV基因组含有8个同源区，每区含有不等的重复或倒置重复序列，这些重复序列由位于中间的不完整回文序列及其两侧各约20bp的序列构成。同源区是杆状病毒基因组普通存在的功能域结构，对于基因表达的调节具有增强作用，同时也是 DNA复制的原点。

杆状病毒中现已鉴定的基因近70种，可分为结构蛋白基因和非结构蛋白基因两大类。结构蛋白基因如 polh、P10、gp64、p6.9、gp41、vp39等基因。非结构基因中，与DNA复制相关的重要基因有helicase基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等；起表达调节作用的基因主要有 ie-1、ie-2、lef类基因、p35、pe38等。

2、杆状病毒载体表达系统的特点

AcNPV病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同源重组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。由于多角体基因启动子在感染后18~24h开始转录和翻译，一直持续到70 h。外源基因置换掉多角体基因后，并不影响后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能。

杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白的表达中得到广泛应用，例如用于表达白介素(IL)一2，3、BMP及多种病毒蛋白等。相对其他表达系统它具有以下几个方面的特点：

①重组蛋白具有完整的生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达 的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。

②能进行翻译后的加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致：对比实验证明，在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。这种不一致对不同目的蛋白的活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。

③表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50％。

④能容纳大分子的插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限。

⑤能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。

另外，昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能，能表达基因组DNA；还有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。最后，杆状病毒对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其启动子在N-％动物细胞中没有活性，因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白时可能优于其它系统。

3、杆状病毒载体的重组与筛选

杆状病毒由于基因组庞大，外源基因的克隆不能通过酶切连接的方式直接插入，必须通过转移载体的介导．即将极晚期基因(如多角体基因及其边界区)克隆入细菌的质粒中，消除其编码区和不合适的酶切位点，保留其5’端对高效表达必需的调控区，并在其下游引入合适的酶切位点供外源基因的插入，即得到转移载体。将要表达的外源基因插入其启动子下游，再与野生型AcNPV DNA共转染昆虫细胞，通过两侧同源边界区在体内发生同源重组，使多角体蛋白基因被外源基因取代。而将外源基因整合到病毒基因组的相应位置，由于多角体基因被破坏，则不能形成多角体。这种表型在进行常规空斑测定时，可同野生型具有多角体的病毒空斑区别开来 ，这就是最初的筛选重组病毒的方式。但由于重组效率较低(0.1％-1％)，表型差别不显著，应用上有一定的困难。为此，经过不断探索，在重组杆状病毒的筛选与鉴定方面取得了很大改进，具体方法有以下几种。

（1）半乳糖苷酶的蓝白筛选

1990年，Vialard等在多角体基因的上游，利用pl0基因启动子带动LacZ基因构建了转移载体pJVNheI。将其共转染sf细胞后，重组病毒可表达B-半乳糖苷酶，通过加入x-gal使之形成蓝色空斑，便可进行重组病毒的筛选。1990年，Kins提出了线形化技术，其原理是线形化的杆状病毒基因组感染性很低，但仍具有与引入细胞内的同源序列进行同源重组的能力。如果同源序列位于线形化杆状病毒的两端，则基因组即可环化恢复完整的感染性，使阳性重组率大大提高。

（2）体外酶促定位重组 

Cre-Loxp系统最早由Sternberg等最早建立，噬菌体Pl含有1个重组位点Lox(1ocus of(rossover)和1个Cre酶基因，其产物(Cre酶)为重组所必需：Cre酶已被克隆纯化；Lox序列已被测定由34个核苷酸组成，其两端为13 bp的反转重复序列。中间为8 bp的非回文序列。将此序列引入AcNPV基因组即得vAclox，转移载体引入lox后可获得plox。vAclox和 plox在Cre酶存在条件下，两者即可发生体外定点重组，而将载体上的相应序列转到病毒的基因组中(这是1个可逆酶促反应)，将反应混合物转染草地夜蛾(spodoptera frugiperda)sf细胞中，即可得到高比例的重组子代病毒。这个方法的特点是体外重组，通过控制反应的条件可达到很高的重组率。但由于重组是位点特异性的，反应产物往往是转移载体多次插入亲代病毒的结果，因而要进行多轮空斑实验纯化病毒。

（3）Bacmid

后来Luckow等又发明了一种新的杆状病毒重组技术。他们根据 F因子载体原理，用类似于酵母体内重组的方法，构建了一种新杆状病毒穿梭载体Bacmid。该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性。Bacmid含有F因子复制子(可在大肠杆菌中复制)、卡那霉素抗性基因及Tn7转座位点attTn7。转移载体中，外源基因置于杆状病毒启动子之下，两端分别为Tn7的左右端。以其转化含Bacmid的E coli菌株，由辅助质粒提供反式作用发生转座，而将外源基 因转到 Bacmid的attTn7位置。这种重组了外源基因的 Bacmid转染的昆虫细胞 ，可得到 100％阳性重组病毒。这种方法都是在大肠杆菌中进行的，非常简便，由于没有本底干扰 ，同样不需进行空斑纯化。缺点是 F因子提取不很方便，其稳定性也有待于观察 。

（4）TK基因

胸苷激酶可将核苷类似物转变成的有毒的中间体而抑制病毒的复制。该核苷类似物作为疱疹病毒编码胸苷激酶(HSV—TK)的底物，能特异性地抑制单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和EB病毒的复制。由于这些类似物对病毒的胸苷激酶有高度的选择性，而细胞 自身胸苷激酶对这些类似物的结合常数很低 ，故能选择性地杀死表达 HSV-TK基因的细胞。

（5）Neo基因

Neo是经典的显性选择标记，这是一种细菌编码的磷酸转移酶基因，可使氨基糖苷类抗生素 G418失活。后者又是一种蛋白质合成抑制剂，可干扰真核细胞80S功能。Neo曾被引入几种脊椎动物病毒(如痘苗病毒和EB病毒)的基因组中，作为选择标记。1989年，Jarls将Neo引入sf细胞染色体中而得到 G418抗性的细胞系，说明Neo可作为选择标记用于重组病毒的筛选。本方法和TK基因相比较略显繁琐，需经连续传代，但其不用改造辅助病毒，只需在转移载体中引入Neo基因即可。其它如 PCR、DNA斑点杂交及有限稀释法等，也可用于筛选重组病毒。以上方法各具特点。虽然有些新方法需一定的条件，但一旦建立起来后就可方便、迅速地得到重组病毒，为杆状病毒表达系统的普及应用创造了良好的条件

4、影响外源蛋白表达的因素

利用杆状病毒昆虫表达系统表达外源基因的理论基础，就是杆状病毒的基因表达与调控，但有关病毒晚期基因高表达和其调控机制目前还不十分清楚。利用多角体基因的启动子表达外源基因，影响表达水平的因素除与病毒本身的因素有关外，还与受感染细胞的种类和生理状况乃至培养基的质量有关。

（1）病毒的稳定性

杆状病毒在细胞中多次传代后，可能引起基因组的变化。最明显的变化就是形成ov的能力 降低。由于细胞间不需要ov形成感染，只需通过BV病毒感染即可。多次传代的病毒也可能出现少多角体(few polyhedfin，FP)表型的变化，一般每个感染细胞只含有10个多角体病毒。其中突变病毒多角体的表达水平也有所降低，应用这种突变病毒会对外源基因的表达带来不利。若重组前病毒是变异FP，通过肉眼分辨重组与非重组病毒时，有可能发生假象。另外，长期多次传代的病毒也往往引起表达水平的降低，为避免上述情况的发生，要限制病毒的传代次数，一般控制在2-3代以内。

（2）在昆虫细胞内表达与幼虫体内表达

虽然目前大部分工作是在细胞培养条件下进行的，当需要大量制备某类表达产物时，最好采用昆虫蛹。因为培养昆虫幼虫远比培养细胞简单、便宜，而且在昆虫体内培养可以提高表达量。一般在幼虫体内的淋巴液中，蛋白含量较在细胞培养基中高l0倍以上，例如小鼠IL-3的表达量在淋巴液中较在细胞培养上清中高500倍，可能是细胞培养基中含有的蛋白酶使之降解所致。

（3）启动子类型

在构建转移载体时，使用不同的启动子就需构建相应的同源序列。目前最常用的启动子有晚期Polh(polyhedrin)启动子和P10启动子，还有碱性启动子以及少数早期启动子。同一目的基因在不同启动子控制下，表达水平会有很大差异。研究发现，分泌类蛋白使用PIO启动子或碱性启动子的效果更好。

（4）外源基因序列的本身因素

能在重组杆状病毒有效表达的外源基因5’端及3’端非编码区越短越好，一般长度在3～400个核苷酸以内。影响表达的其他因素包括：密码子的使用情况(是否为昆虫细胞所常用)、mRNA的稳定性及蛋白质的稳定性等。外源基因附近的序列很重要。Kozak分析了数百个真核序列，得出两点结论：首先，启动子下游第1个ATG常作为起始密码子；其次是在 ATG附近的序列并不是随机的。有95％表达的真核基因在ATG前-3位是嘌呤(而且常是A)，+4位是G。如果-3的A或+4的G有1个被嘧啶替代，翻译水平就下降5~l0倍。如果-3位和+4位均被嘧啶所替代，翻译水平就下降20倍。因此，Kozak提出，(GCC)GGC A／GCC AUG G是高等真核基因起始密码附近的保守序列，其中-3处A最为保守。

（5）重组病毒基因的表达与调控

多角体启动子控制的外源基因的表达，紧靠上游的序列对基因的转录调节是最重要的。许多研究表明，当外源基因5 端加有1～58个多角体蛋白的氨基酸序列以融合蛋白形式表达时，效果最好。用高、中与低3种表达的外源基因进行实验的结果表明，保留一部分多角体5’端序列与外源基因以相同的框架相融合，表达水平最高；如果框架不同，那么从距启动子最近的起始码开始翻译，表达产物水平相对偏低。

昆虫杆状病毒系统表达外源基因的新进展

1、杆状病毒载体及其表达系统进展

昆虫杆状病毒表达系统进行外源基因表达时，存在的一个问题是筛选带有外源基因的重组病毒的效率较低(最初仅0.1％～1％)，而且产物较难纯化。为此，人们设计了各种方法来改进病毒载体，如 NPV DNA线性化，体外定点酶促重组，以及酵母-昆虫细胞和大肠杆菌-昆虫细胞的穿梭载体的开发等。其中Posse等设计的重组-救活可线性AcNPV病毒载体BacPAK6的重组效率较高，高达80％以上，具有重要的应用价值。该重组技术的基本原理为：先找一个在 AcMNPV基因组中不存在的 Bsu36 I酶切位点，采用体外突变，在多角体基因两侧的非必需基因ORF603基因和必需基因ORF1629基因中各引入一个Bsu36 I位点，然后通过重组将突变了的由ORF603基因、多角体基因启动子控制的半乳糖苷酶基因、ORF1629基因引入AcNPV基因组，获得重组病毒载体BacPAK6。(BacPAK6)DNA经Bsu36 I酶切而破坏了必需基因OBF1629，因而靠自身环化不能成活，必须与携带多角体蛋白基因启动子控制的外源基因和OBF1629基因的转移载体发生重组，病毒才能复制而救活，因此，该法的重组率很高。这一系统现已扩展到了BmNPV表达系统。易咏竹等副通过克隆的家蚕核多角体病毒解螺旋基因DNA，与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖 核多角体 病毒基 因工 程载体 病毒(BacPAK6)DNA在昆虫细胞中发生重组，经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf-21的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体(HyBacPAK6)，它与含植酸酶基因的转移载体Pvl1393phy在家蚕细胞中的重组率达90％以上。

此外，Bac—to．Bac表达系统是效率很高的表达系统，它利用穿梭质粒bacmid在大肠杆菌 中高效复制后，再提纯用于转染昆虫细胞，大大缩短了时间。王汉中等根据BactoBac表达系统的基本原理，也构建了一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统(HaBac—to—Bac)。该系统中供体质粒pFastPhP10中插入了带有多角体启动子序列的完整的多角体蛋白基因，因而多角体蛋白基因的表达和包涵体的形成也可作为转染成功的重要识别标记等，这是商品化的 AcBac—to．Bac系统所不具备的。

目前可被应用于昆虫杆状病毒表达系统的细胞系较多，但应用较多的细胞系是秋粘虫s.frugiperda卵巢组织的细胞系sf-9，以及家蚕细胞系。洪华珠等建立了一株高水平表达重组蛋白的昆虫细胞系HNU—Tn.FB1。它是粉纹夜蛾Trichoplusia ni脂肪体的传代细胞系。在辅以 5％胎牛血清的商品无血清培养基 Excell400中，该细胞群体的倍增时间为22.9h，最高密度可达2.2×106／ml，表达由AcMNPV构建的重组p.半乳糖苷酶的水平达(225.5±13.4)IU/ml。该细胞系在表达重组蛋白方面与目前商业上最好的“高五”细胞(BTI．Tn．5B1-4)相当，是一株很有价值的细胞系，具有广阔的应用前景。

另外，一些影响杆状病毒系统表达外源基因产物的因素在近两年得到了研究。杆状病毒吸附宿主细胞的动力学参数是影响细胞感染效果和表达物产量的因素之一。Petricevich等  以表达轮状病毒的重组蛋白VP4为例，对病毒吸附动力学的参数进行了研究 ，发现影响细胞感染效果的主要参数是胎牛血清浓度。不用胎牛血清或经高温处理后再使用，反而可以获得更高浓度的表达产物。重组病毒感染 sf-9的效果与细胞周期有关，Saito等对GFPuv基因在杆状病毒系统中表达的研究表明，当在宿主细胞的G.期感染时，细胞内的荧光强度是在G2／M期感染的 1.3倍 ，同时在宿主细胞的G。/S期感染时，感染量是在G：/M期感染的1．5-1．8倍。该研究结果对于选择病毒感染宿主细胞的时期有一定的借鉴意义。01ejnik等讨论了高渗透压对昆虫细胞表达重组蛋白产量的影响。采用补料分批培养发现，Trichoplusia ni BTI.TN.5B1-4(Tn-5)细胞具有很强的耐高渗透压能力，表达的重组核蛋白产量比等渗环境下的高出72％。该结果对于提高重组蛋白的产量具有重要意义，可能的原因是高渗透压下，葡萄糖的比耗率增加，细胞内重组蛋白的合成代谢更加旺盛。另外，杆状病毒易被紫外线钝化，Dustin等  将海藻病毒的嘧啶特殊二聚物糖基化酶(CV．PDG)用杆状病毒(AcMNPV)表达后，发现重组 AcMNPV受紫外线钝化的影响比野生型降低了3倍。该研究为提高杆状病毒抗紫外线能力提供了一个可行的办法。

2、杆状病毒表达系统的最新应用

杆状病毒表达系统 由于对外源基因克隆容量大，重组病毒易于筛选 ，具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点，现已广泛用于一些在其它表达系统表达有困难的高价值蛋白质的表达。新近报道的如人骨骼肌基因突变而产生的a-辅肌动蛋白，一直未找到较好的系统来表达它。Akkari等首次采用杆状病毒系统实现了它的高效表达和纯化。钙运转调节肽(caltfin)在动物授精过程中可以抑制钙流人精子，避免过早地产生顶体反应而导致授精失败。目前获取它的唯一方法是从动物体内提取，但如能通过生物技术手段大量生产，无疑具有广阔的应用前景。Phan等首次用昆虫杆状病毒系统高效表达了cahrin，并筛选出了有效的纯化方案。新近用杆状病毒表达系统表达成功的其它一些高价值蛋白见表2。

昆虫杆状病毒系统的应用展望

由于昆虫杆状病毒表达系统独特的性质，现已被广泛应用于药物研发、疫苗生产、重组病毒杀虫剂等众多领域中。近几年的研究发现，AcNPV病毒也可以将外源基因导入哺乳动物的细胞，如人的肝细胞。这意味着AcNPV病毒可能成为哺乳动物基因治疗的媒介载体，因此杆状病毒有望在未来人类的基因治疗中得到应用。

另一方面，利用昆虫杆状病毒系统进行重组杆状病毒杀虫剂的研究也仍然具有十分重要的意义。由于昆虫杆状病毒对人、畜安全，不易引起广泛规模的生态平衡的破坏等特点，昆虫病毒杀虫剂已成为当今生物农药研究与开发的热点。但野生型杆状病毒有必要进行重组改造，因其杀虫速度较慢。此外，昆虫杆状病毒系统本身及其相关技术尚需进一步完善和提高。如该系统无法进行连续性表达；糖基化方式与哺乳动物细胞存在一定差异，糖侧链甘露糖的成分较高，而复合寡糖缺乏。在杆状病毒系统的基础研究和应用技术方面，目前杆状病毒的基因组学，特别是功能基因组学的研究相对薄弱，有关病毒晚期基因的高表达和调控机制等仍不明了。另外杆状病毒可能的其它宿主还不十分清楚，表达产物的纯化和多元表达等方面的技术还不够理想等，都需要今后进一步研究。当前应重点加强杆状病毒的基因组学，特别是功能基因组学的深入研究，一是有助于杆状病毒载体的进一步改良，二是随着一些调节外源蛋白表达的基因结构和功能的深入了解，有利于外源基因的高效表达和调控。

昆虫杆状病毒表达系统安全性好，表达水平高，可进行翻译后加工及表达产物的异源性小，是一种非常理想的真核表达系统。目前研究及应用最多的杆状病毒为AcNPV，尽管它可感染30多种细胞，但主要在sf细胞中繁殖，因此，对于其它细胞是否易感，以及外源蛋白的表达水平、转录后加工等问题还需深入研究。如果在重组产物纯化过程中混有昆虫细胞的蛋白，则可能在应用时引起过敏反应。所以，如何进一步纯化表达产物，将其致敏原性降到最低限度是值得重视和探讨的问题。

由于该系统独特的性质，使其被广泛地应用于基因工程、药物开发、疫苗生产、表达免疫活性分子和某些致瘤病毒蛋白以及基因表达调控研究等多个领域中。迄今为止，已有数百个基因在昆虫细胞或幼虫体内得到高效表达，为获得大量的类原型蛋白及其功能研究提供了可能。