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昆虫杆状病毒表达系统的研究进展

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体外基因表达

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞,它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定,但是表达基因的相对分子质量有限,不宜过大,且不能对表达产物进行一些翻译后加工 、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性,日益受到人们的重视。

1、杆状病毒的生物学特性

杆状病毒只来源于无脊椎动物,虽然已发现600多种杆状病毒,但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子,大小为80~160 kb,其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内,后者具有较大的柔韧性,可容纳较大片段的外源DNA插入,因此是表达大片段DNA的理想载体。其中,用作外源基因表达载体的杆状病毒,目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus,NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒,呈多角体形状。

核型多角体病毒有两种形式:一种为包含体病毒(occluded virus,OV),另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus,BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同,包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式,昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体,即为29 000的多角体蛋白,它对病毒的水平感染起以下作用:

①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。

②保证病毒颗粒在适当的位置释放,引起感染。

昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5),可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式,由细胞芽生出BV,进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。

近几十年,有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速,其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus,MNPV),简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae的原型,是一种大的、带外壳 的双链DNA病毒,能感染30多种鳞翅目昆虫,被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒,主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil,BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白,且成本低,显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒,BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。

AcNPV的基因表达分为4个阶段:立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。

前两个阶段的基因表达早于DNA复制,而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中,有两种高效表达的蛋白,它们是多角体蛋白和P10蛋白。

多角体蛋白是形成包含体的主要成分,感染后期在细胞中的积累可高达30%~50% ,是病毒复制非必需成分,但对病毒粒子却有保护作用。可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白,也是一类病毒复制非必需成分,可在细胞中形成纤维状物质,可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力,因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。

2、杆状病毒基因组的结构和功能研究

杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内,核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白;髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。

目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角体病毒(BmNPV) 、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV) 、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV),以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)。

目前AcMNPV基因组的研究最为深入,它是双链超螺旋大分子环状DNA,其大小为90~160kb,约编码154个基因。AcMNPV基因组的基因组织(gene organization)较为复杂,基因组的不同区域具有功能分化,基因的分布尚无规律可循,但AcMNPV基因组含有8个同源区,每区含有不等的重复或倒置重复序列,这些重复序列由位于中间的不完整回文序列及其两侧各约20bp的序列构成。同源区是杆状病毒基因组普通存在的功能域结构,对于基因表达的调节具有增强作用,同时也是 DNA复制的原点。

杆状病毒中现已鉴定的基因近70种,可分为结构蛋白基因和非结构蛋白基因两大类。结构蛋白基因如 polh、P10、gp64、p6.9、gp41、vp39等基因。非结构基因中,与DNA复制相关的重要基因有helicase基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等;起表达调节作用的基因主要有 ie-1、ie-2、lef类基因、p35、pe38等。

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