外源基因在昆虫细胞中的表达

昆虫属于高等真核生物，昆虫细胞生长速度快，易于悬浮培养。昆虫表达系统具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工，其抗原性、免疫原性和生物活性等与天然蛋白质相似，并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品等优点，因此，昆虫表达系统是较理想的重组真核蛋白质表达系统。

外源基因在昆虫细胞中的表达的基本原理：常用的昆虫表达系统主要有果蝇表达系统（drosophila expression system, DES）和杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system, BEVS）两类。

1. DES 该表达系统结合了昆虫高水平表达和哺乳动物细胞非溶解、稳定表达的优点。DES使用的宿主为黑腹果蝇（drosophila melanogaster）晚期胚胎的S2细胞，常用的质粒载体有pDS47、pAc5.1和pMT等。

载体上的启动子分别为DS47、Ac5和MT，以便重组蛋白能稳定或瞬时高水平表达。该系统是非溶解性的，受体细胞在转染后2天即可获得蛋白质的短时高水平表达。表达载体可以连续表达，也可诱导表达。

2. BEVS 杆状病毒表达载体是一种依赖辅助病毒的真核DNA表达载体，仅有质粒载体不能表达外源基因，还需要野生型杆状病毒辅助。野生型杆状病毒感染昆虫细胞能力强，感染后可形成病毒空斑。

其基因组为双链闭环DNA，当携带外源基因的转移质粒与线性化病毒DNA共同转染昆虫细胞后，通过同源重组形成整合有外源基因的重组杆状病毒才能完成外源基因的表达。

另外，pFastBacTMHT也是一种杆状病毒表达系统（Bac-to-Bac®）的载体。该穿梭载体可与杆状病毒DNA先在特定的大肠埃希菌感受态细胞中形成重组杆状病毒质粒（bacmid），并通过蓝白筛选鉴定重组体；然后再感染昆虫细胞。

所生成带组氨酸标签的重组蛋白，可使用镍螯合树脂亲和柱快速纯化。常用的昆虫基因导入方法有磷酸钙共沉淀法和脂质体介导法。

DES操作相对简单，如大肠埃希菌表达系统一样，只需构建携带外源基因的质粒载体，再通过磷酸钙沉淀或脂质体介导法将其导入宿主细胞即可。

BEVS须先构建携带外源基因的转移载体，然后与野生型杆状病毒共同转染宿主细胞，才能获得具有感染能力的重组病毒；或采用穿梭载体，先构建携带外源基因的杆状病毒质粒，再感染宿主细胞。外源基因在昆虫细胞中的表达的基本过程可分为如下几步：

（一）流程一

将外源基因转移至载体

通常在载体插入序列两侧都有部分病毒基因序列，以便与野生型线性病毒DNA，如常用的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）DNA进行同源重组。验证插入基因方向的正确性。扩增并纯化质粒。

（二）流程二

可采用电穿孔、脂质体（实验流程8-4）或磷酸钙共沉淀（实验流程8-5）方法进行转染。

通过同源重组，产生具有复制、感染能力并携带有外源基因的病毒颗粒。有些载体可同时携带如β-半乳糖苷酶等筛选标记，以利阳性重组子的筛选。

实验流程8-4昆虫细胞外说DNA的脂质体转染法

A、在6孔组织培养板中，种入9X10⁵/孔Sf9细胞（2 ml Sf-900II SFM，含抗生素）或9X10⁵/孔BTI-TN-5B1-4细胞（2 ml EXPRESS-FIVE SFM，含抗生素），28 ℃培养1 h以上以使细胞贴壁。

B、在2个12 mm X 75 mm试管中，分别配制下列溶液：

溶液A：每次转染，稀释1-2 µg杆状病毒DNA和5µg转移栽体于不含抗生素的100 µl Sf-900Il SFM或EXPRESS-FIVE SFM溶液中。

溶液B：每次转染，稀释1.5~9 µI CELLFECTIN试剂于不含抗生素的100 µl Sf-900II SFM或EXPRESS-FIVE SFM溶液中。

C、将溶液B加入到溶液A的试管中，轻轻混匀，室温孵育15 min。

D、待脂质体/DNA复合物形成后，从步骤A获得的Sf9细胞以2 ml/孔不含抗生素的Sf-900ⅡSFM洗涤1次。

E、在含脂质体/DNA复合物的试管中，每管加入0.8 ml Sf-900ⅡSFM，轻轻混匀。吸取洗涤培养基，将稀释的脂质体/DNA复合物铺于洗涤后的细胞上，27 °C培养5 h。

F、去除转染混合物，每孔加入2 ml含抗生素的Sf-900II SFM或EXPRESS-FIVE SFM溶液，27 ℃继续培养72 h。

实验流程8-5昆虫细胞中导入外源DNA的磷酸钙沉淀法

Day1.准备

A、在35 mm培养皿中接种3X10⁶ S2细胞于3 ml培养基中（1X10⁶/ml）。、

B、28 ℃培养6~16 h至细胞密度达2X10⁶~4X10⁶/ml。

Day2.瞬时转染

C、取两个微量离心管（Eppendorf管），配制下述溶液：

溶液A：2 mol/L CaCl₂ 36 µl，重组DNA（19 µg）；加灭菌水至终体积为300 µ1。

溶液B：2XHEPES缓冲液300 µl（50 mmol/L HEPES，1.5 mmol/L Na₂HP0₄，280 mmol/L NaCl，pH7.1）。

D、将溶液A逐滴加入B，不断轻振管壁，室温孵育30~40min（将会出现细小沉淀）。

E、混匀溶液并逐滴添加至培养的细胞中，每次加入时均需液涡混匀，28 ℃孵育16~24 h。

Day3.转染后

F、细胞洗涤去除磷酸钙。上述细胞以完全培养基洗涤2次，离心（1000 g，5~10 min）收集细胞。加入新鲜培养基，28 °C继续培养。

G、如果应用诱导型表达载体（pMT/BioEase-DEST，pMT/VS-His，或pMT/BiP/V5-His），当细胞生长到达对数期（2x10⁶~4X10⁶/ml）或转染后的1~4 d，加入终浓度为500 µmol/L的硫酸铜开始诱导表达，诱导时间约为24 h。

Day4.细胞收获及检测

（三）流程三

收集转染细胞上清

（四）流程四

病毒扩增

（五）流程五

表达及检测

尽管昆虫细胞的倍增时间较短（18-24小时），但它们只能在一个较狭窄的细胞密度范围内生长，如Sf9和Sf21细胞在含血清培养基中的生长密度范围约为1x10⁶-4x10⁶/ml。

若密度过低，细胞会停止生长；密度过高，1天后细胞就会开始死亡。因此，约每2-3天必须分瓶传代一次，以保待适当的细胞密度。当连续传代至细胞倍增时间显著增加或对病毒的敏感性明显降低时（一般在无血清培养基中传代30-50次），应弃之。

重新复苏冻存细胞、开始新一批培养。