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【转帖】[转贴]外源基因在原核细胞中的表达

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[生物技术] [转贴]外源基因在原核细胞中的表达
内容
一、大肠杆菌表达外源基因的重要性
二、大肠杆菌表达外源基因时考虑要点
三、原核细胞表达外源基因的基本条件
四、外源基因在大肠杆菌表达的主要方式
五、外源基因在大肠杆菌中高表达
六、外源基因在大肠杆菌中的可溶性表达
七、存在问题

一、大肠杆菌表达外源基因的重要性
1、 大肠杆菌结构简单,遗传背景清楚,基因表达调控机制明确,是表达外源基因合适宿主。
2、大肠杆菌易在简单,廉价培基中高密度培养,便于大规模生产。
3、外源蛋白可在大肠杆菌中获得高表达,便于大量生产具有生产或研究价值的天然蛋白。
4、是研究外源基因结构/功能/表达调控合适宿主。
5、对环境是安全的。

二、大肠杆菌表达外源基因时考虑要点
1、 大肠杆菌与其它宿主细胞不同,有其独特表达外源基因的机制,且基因表达是顺式DNA序列与反式蛋白调控因子相互作用的结果,基因表达水平既决定于合理设计DNA表达元件,也决定于宿主细胞种类。
2、基因表达种类可分为组成型和诱导型两类。
外源基因高表达,尤其表达产物对细胞有毒性时应采用诱导表达。
诱导种类:温度诱导和化学制剂诱导。
3、转录和翻译高度偶联、相互影响
核糖体在 mRNA 上结合或移动情况影响 P因子依赖、转录终止的效率。
核糖体的翻译和停顿对转录减弱也起很大作用。
4、以多顺反子形式表达外源基因
基因间spacer不同,具体表达机制也所不同,对外源基因表达有影响。
spacer长,两个基因翻译起始相互独立。
spacer序列长度相当于正常SD序列到起始密码子距离,并具有SD序列特性,小亚基不离开mRNA,大亚基暂时离开。
前一基因终止密码子与后一基因起始密码子部分重叠,核糖体两个亚基都不离开mRNA。
在多顺反子mRNA中,各基因表达产物数量不等,如乳糖操纵子,半乳糖苷酶;半乳糖苷透性酶;半乳糖苷乙酰化酶大约为1: 0.5: 0.2
5、缺乏转录后加工、翻译后修饰能力。
三、原核细胞表达外源基因的基本条件
1、原核表达载体
提供转录、翻译所必须的调控元件,如启动子、转录终止子、核糖体结合位点等。
(1)理想原核表达载体具备的基本特征:
A、具有能自主复制的复制子,松弛型,质粒高拷贝数,便于质粒大量制备及表达。
B、强启动子、强转录终止子,便于高水平转录,防止转录通读。
C、可诱导性,尤其在高表达对细胞有毒性的蛋白。
D、合适的核糖体结合位点,提高翻译起始效率和翻译水平。
E、具有多个单一酶切位点的多克隆位点,且酶切位点最好位于被检测的表型基因上,便于外源基因插入及筛选。
F、分子量小,便于较大外源基因的插入。
G、具有抗药性标志,有利于插入外源基因克隆的筛选。
H、安全,不污染环境,对人无害。
(2) 常用启动子:
A、lac. 底物X-gal,诱导剂IPTG,产生蓝色
B、trp. 化学诱导;诱导剂:b吲哆丙烯酸或吲哆-3-乙酸
C、l PL、PR启动子,CI基因温度突变体,温度诱导
D、T7
E、tac. 杂合启动子,trp-35-lac-UV5 可被异丙基硫代半乳糖苷诱导
导剂:b吲哆丙烯酸或吲哆-3-乙酸
C、l PL、PR启动子,CI基因温度突变体,温度诱导
D、T7
E、tac. 杂合启动子,trp-35-lac-UV5 可被异丙基硫代半乳糖苷诱导
2、外源基因
必要条件:不含内含子
基因来源:
(1)Genomic DNA( 原核) (2)cDNA( 真核)
(3) 人工化学合成( 选择细菌偏爱的密码子) (4)PCR 扩增
四、外源基因在大肠杆菌表达的主要方式
(一)从表达蛋白结构来分
1、天然蛋白直接表达:
(1)基本条件:
A、载体应有细菌核糖体的结合部位,不含有结构基因。
B、外源基因:含启始密码子 ATG及全基因。
来源:a. 化学合成
b. 化学合成DNA与酶促制备cDNA相结合
化学合成 + 酶切后的cDNA
用限制性切除目的基因信号肽,目的基因信号肽,目的基因部分氨基末端氨基酸和3’非翻译区。
c. PCR法:扩增不含内含子基因
(2)存在问题:
分子量>15000 Doltons外源蛋白对E.coli蛋白酶有抗性,但小分子多肽极易被蛋白酶降解,难以高表达。
2、先表达融合蛋白,后通过裂解产生天然蛋白
(1) 优点:
A、有利于高表达(大肠杆菌高表达调控元件) B、分子量大,稳定 C、易于分离鉴定及纯化 D .可溶性及分泌表达
(2)考虑要点:
A、载体含有启动子,核糖体结合位点和部分结构基因。
B、保证拼接基因正确转译相位
a. 同聚寡核苷酸(dG和dC,dT和dA)分别连接载体和基因DNA。
b. 构建一组(三个)载体,使每个载体与相对于转译起始密码ATG转译相位的位点不同。
C、合理选择保护性多肽:
常用有b-galactosidase、tryptophan结构基因等。
a. 保护蛋白使融合蛋白PH调整到中性或酸性。
Somatomedin(PI 9.30),直接表达,表达很高但极易降解,将其与酸性多肽LH融合(PI 5.82),表达水平占总蛋白20%以上,4.5x105分子/细胞
原因:碱性蛋白在E.coli中易受蛋白酶降解。
b. 小肽多个连接,增加稳定。
Somatomedin基因多个连接,增加稳定表达。
D、酶学和化学法选择性裂解融合蛋白:
GrBr.裂解Met,生产胰岛素;
Somatomedin、Acromobacter、Protease I(API)特异裂解Lysine,生产d-hANP。
(二) 从表达产物分泌性来分
1、分泌表达:表达载体或外源基因含信号肽。
常用信号肽:b-lactamase、alkaliphospatase、OmpA、ProteinA
优点:1)防止蛋白酶降解2)有利于纯化3)表达产物N端不含有Met 4)大多为可溶性表达
2、非分泌表达
(三)从表达产物可溶性来分
1、可溶性表达
2、包涵体表达
五、外源基因在大肠杆菌中高表达
1、增加外源基因拷贝数
1) 增加质粒拷贝数
A、采用松弛型质粒,如ColE质粒,正常情况下20-40拷贝/细胞,氯霉素扩增后,2000-3000拷贝/细胞。
B、选择合适的宿主:不同质粒在其宿主中拷贝数或同一质粒在不同宿主中拷贝数都不相同。
2)增加质粒稳定性
A、强启动子如rrnB启动子和高拷贝噬菌体启动子影响质粒复制,使质粒不稳定易丢失。
B、强转录终止子序列增加质粒稳定性,如将rrnB转录终止子插入上述强启动子远处,增加质粒在细胞中稳定性。
C、外源基因表达与否对表达质粒稳定性的影响
在克隆基因表达阻断条件下,生长200代,质粒结构是稳定的。在外源基因表达情况下,传100代,只有10%质粒具有外源基因的功能。
2、转录水平
1)强启动子
A. lpp启动子相对强,trp启动子比lac强,tac启动子比lac UV5启动子强11倍,比trp强3倍。
B.启动子串联:连续三个trp启动子比单个trp启动子表达水平高4-5倍。
C. trp启动子除去减弱子,提高表达几种激素的水平。
D. -35和-10共同序列以及两个序列间距离(不是序列)十分重要,间隔17bp转录水平最高。
Pribnow框:-10,T80 A95 T45 A50 T96。RNA聚合酶结合位点,此序列影响开放性启动子复合物的形成速度,控制转录。
Sextama:-35序列,T82T84G78A45。
RNA聚合酶识别位点,这一序列核苷酸结构很大程度上决定启动子强度。
2) 强转录终止子如fd phage 或 rrnB 终止子对完全阻止转录是必要的,阻止通读,增加基因表达。
3) mRNA稳定性
mRNA半衰期:数秒-25分钟。
mRNA降解原因:外切酶和内切酶降解。
降解mRNA的酶主要是3’外切核酸酶。
防止降解:原核mRNA对外切酶和内切酶降解的敏感性是不同的,其原因可能是其序列和结构的差异。
A. mRNA某些结构序列保护mRNA不能降解。 如:3’端茎环结构,转录终止子结构。
B. 在mRNA5’端加上单一发夹结构,延长不稳定mRNA寿命,如:E.coli ompA转录物的5’非翻译部分可作为mRNA的稳定剂。
C. 核糖体能保护mRNA不被内切酶降解,改变翻译效率,影响mRNA稳定性。
D. Rnase缺陷株
3、翻译水平
翻译水平起始效率对基因表达有显著的调节作用,主要决定于mRNA的结构特性。
(1)SD序列:ATG周围序列,SD和ATG间距离和序列对翻译效率有很大作用。
A. 起始密码子
使用频率:AUG(91%) GUG(8%)UUG(1%)
起始效率:AUG较其它强2~3倍,GUG略强于UUG
B. SD序列:
UAAGGAGG比GGAGG高3~6倍(表达水平)
C. SD与起始密码子合适距离:
合适距离 最低距离
GGAGG 5~7 5
UAAGGAGG 4~8 3~4
D. SD与ATG间富含AT有利于翻译
(2)翻译起始区二级结构
A. SD和/或AUG区,茎环结构阻止与30S核糖体亚单位结合,抑制翻译。
B. RBS区富含AT有利于表达。
解决方法:通过二级结构预测和基因突变技术,去除二级结构。
(3)翻译偶联增加表达水平。
(4)去除3’非编码区
3’非编码区和ATG起始密码子,SD序列间可能形成二级结构,例如,IL-2 cDNA,缺失AT、GC结尾部分及3’UTR,表达水平增加500倍。
(5)使用的密码子
选择和使用大肠杆菌偏爱密码子有利于增加翻译效率,但不是影响翻译的主要因素。
Arg(AGG/AGG)影响表达,尤其在mRNA5’处,mRNA翻译抑制愈明显。
Argu基因(dnaY),编码tRNA Arg(AGG/AGG ) 共表达,增加表达。
(6)翻译终止子:
A. UAA是最偏爱,最强终止子。
UAA:RF1,RF2; UGA:RF2; UAG:RF1
B. 终止效率决定于终止密码子和第四位核苷酸
UAAU是最有效终止子。 UAAU (80%),UGAC (7%)。
(7)形成融合蛋白提高基因表达
(8)翻译增强子:
能显著增加基因表达,已在细胞、噬菌体、病毒处证实。
A、T7基因10 leader 区9 bp序列,增加表达40-340倍。
B、mRNA 5’UTR 富含U序列。
ATP E基因SD上游30bp,增加IL-2,b-干扰素,基因表达。
C、起始密码子下游序列。
T7 9-10(T9-T21)增加基因表达。
4、表达产物稳定性:
表达产物不稳定主要是表达产物受蛋白酶降解。
(1)在蛋白酶缺陷株表达
如使htpR和lon基因突变。
PPLmusmc ori质粒在Hb101, lon+htpR+, lon-HtpR+, lon+HtpR- , lon-HtpR-五种宿主细胞中表达水平为1:1:3:15:33。
(2)融合蛋白有助于保护蛋白酶敏感位点的降解。
如Protein A C端在E.coli内易受蛋白酶降解,将Protein G和/ b-galactosidase融合到Protein A的C端,Protein A C末端被保护。
原因:保护性多肽序列在分子表面,防止蛋白酶降解。
(3)分泌
5、宿主细胞:1) 质粒拷贝数 2)转录翻译效率 3)产物稳定性。
6、环境条件等:
(1)诱导剂的使用。
(2)培基成份,碳源、能量、营养、PH等。
(3)发酵时不同培育时间和诱导时间。
(4)生长温度可影响基因表达速率和质粒拷贝数。
六、外源基因在大肠杆菌中的
可溶性表达
(一) 包涵体产生原因
1、重组蛋白本身特性 2、二硫键形成的氧化还原环境不佳 3、重组蛋白过渡表达
4、宿主菌缺失蛋白折叠和运输所需的一些酶和辅助因子
5、重组蛋白表达处周围的化学条件不合适 6、宿主菌生长状态
(二)增加可溶性表达的方法
1、融合表达(硫氧还蛋白融合表达)。 2、分泌表达:合适启动子-信号肽。
3、外源基因和折叠酶基因或分子伴侣基因共表达或融合表达。(DsbA, B)
4、表达产物随机突变或定点突变(如转角氨基酸点突变)。5、改变生长条件:如降低培养温度,改变PH。6、选择不同的宿主菌(硫氧还蛋白还原酶缺陷株)
(四) 二硫键折叠
1、参与蛋白折叠的分子
(1)伴侣分子(chaperones) 两类家族:GroEL/GroES, DnaK
功能:参与蛋白质折叠,转运和装配。
(2) 折叠催化剂
A、 蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide isomerases, PDI)
Dsb家族
功能:进行巯基-二硫键交换,参与二硫键形成和重排。
B、肽基脯氨酸异构酶(Peptidyl-prolyl isomerases, PPI)
RotA, FkpA, SurA和Skp/OmpH
功能:对Xaa-Pro肽键进行异构化,缓慢地对构型进行重排。
七、存在问题
1. 表达产物翻译后不能有效地修饰和加工。
2. 包涵体形成:
表达产物需变性、复性,恢复生物活性,有可能造成二硫键错配,表达产物构型不均一性,活性降低或丧失。
3. 表达产物N端可能含有甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸。
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