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外源基因在真核细胞中的表达

实验分类:

免疫学实验

最新修订时间:

简介

原核表达系统由千产物不能正确折叠以及缺乏翻译后修饰(二硫键配对、信号肽切除、糖基化、磷酸化等)等原因,往往导致表达产物不表现其相应的生物学活性。


因此,在进行真核基因(特别是人类基因)表达时,真核细胞表达系统应该是首要的选择,尤其是对于功能性膜蛋白、需要翻译后修饰的蛋白质、分泌型蛋白质和蛋白质复合物中的亚基组分等,因为这些蛋白质往往只有在真核细胞表达系统中才能获得有完全生物学活性的表达产物。

目前,常用的真核表达体系包括酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统,此外还有动物乳腺反应器和植物表达系统等。

在医学研究中常用到的表达宿主有酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。针对不同表达宿主的特点,可采用不同的载体携带外源基因,如质粒、病毒等。

由于翻译后加工体系的不同,不同真核表达系统表达出来的蛋白质在结构、抗原性和生物活性上存在一定程度的差异。因此,可根据所要表达的蛋白质的种类和用途,选择最合适的宿主和载体。

原理

外源基因在真核细胞中的表达的基本原理可依据表达方式分为分泌表达和非分泌表达、融合表达和非融合表达等。真核表达还可依据外源基因在细胞中表达时间的长短分为瞬时表达或瞬时转染和稳定表达或稳定转染两种类型。

1、瞬时转染
外源DNA不与宿主染色体整合,不能随宿主基因组进行复制,只能在细胞内维持2-3天。瞬时转染方法耗时短,转染方法相对简单,适合于蛋白质表达产物功能的快速分析。一般应在转染后48-72小时内收获细胞进行表达产物的检测和细胞功能的分析。随着细胞的增殖,少数转染细胞很快被未转染细胞稀释。

2、稳定转染
外源DNA整合入宿主细胞染色体,随宿主基因组一起进行复制并被稳定遗传。稳定转染的目的是为获得稳定表达外源目的基因的细胞单克隆,因此需要从转染的细胞中筛选出已转染了外源基因的细胞,通常使用药物(如抗生素G418等)筛选来达到目的。若筛选出高效表达外源基因的细胞单克隆,即获得了该种目的基因的稳定表达细胞株。稳定转染耗时长(一般需要6-8周以上),步骤繁琐,成功率低。

此外,为防止外源基因表达影响宿主细胞活力和功能,还可以用诱导性表达的方式表达外源基因。用于诱导性表达的载体导入宿主细胞后并不表达外源基因,只有去除或给予某些药物,如四环素、他莫昔芬、蜕皮激素等后方可激活外源基因表达。

应用

通过哺乳动物细胞表达系统获得的蛋白质产物,具有与天然蛋白多肤类相似或相同的空间折叠结构及翻译后修饰和加工性质,因此,保证了其生物活性及在体内的吸收、分布等一般代谢过程。基因工程制药可大规模制备和生产治疗用人重组蛋白质产品。

来源:丁香实验团队

操作方法

外源基因在酵母细胞中的表达

酵母是理想的单细胞真核模式生物,具有完整的亚细胞结构和严密的基因表达调控机制。酿酒酵母作为第一个真核生物已于1996年完成了全基因组测序。2009年5月,巴斯德毕赤酵母GS115株1-4号染色体的全序列测定工作也已完成。上述工作为酵母作为基因表达系统的广泛应用奠定了坚实的基础。酵母生长迅速,易于进行遗传操作,可有效转化外源基因并且长期稳定表达,表达的蛋白质可有一定的翻译后修饰,具有生物学活性。其缺

外源基因在昆虫细胞中的表达

昆虫属于高等真核生物,昆虫细胞生长速度快,易于悬浮培养。昆虫表达系统具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工,其抗原性、免疫原性和生物活性等与天然蛋白质相似,并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品等优点,因此,昆虫表达系统是较理想的重组真核蛋白质表达系统。

外源基因在哺乳动物细胞中的表达

哺乳动物细胞无疑是最理想的表达人类基因的系统。哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠,提供准确的O-和N-糖基化等多种翻译后加工功能,因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学活性方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。

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