外源基因在酵母细胞中的表达

酵母是理想的单细胞真核模式生物，具有完整的亚细胞结构和严密的基因表达调控机制。酿酒酵母作为第一个真核生物已于1996年完成了全基因组测序。

2009年5月，巴斯德毕赤酵母GS115株1-4号染色体的全序列测定工作也已完成。上述工作为酵母作为基因表达系统的广泛应用奠定了坚实的基础。

酵母生长迅速，易于进行遗传操作，可有效转化外源基因并且长期稳定表达，表达的蛋白质可有一定的翻译后修饰，具有生物学活性。

其缺点之一是蛋白质糖基化与真核细胞显著不同，常常含有过多甘露糖的糖链；二是缺乏加工某些高等真核蛋白质的细胞成分。

常用的酵母细胞表达载体多为穿梭质粒载体，它们可在大肠埃希菌中进行筛选和扩增，随后在酵母细胞中进行表达。应用最广泛的酵母细胞表达载体是由pBR322衍生而来的，它含有可保证其在大肠埃希菌中具有高拷贝数的复制起始位点（ori）及amp'、tet'等抗生素筛选标记。

酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、Difco氮原、NaOH

山梨醇缓冲液、酵母裂解酶、乙酸钾、异丙醇、TE、乙酸钠、LiAc

一般可用乙酸锂电转化法（酿酒酵母）、电穿孔法（毕赤酵母）等。阳性重组子可采用抗性标记进行筛选。最后应用电泳染色或免疫印迹法检测外源蛋白质的表达情况，并应用不同的生物学方法分析蛋白质活性。

一、酵母培养基的配制

YPD 培养基

10.0 g酵母提取物、20.0 g蛋白胨 20.0 g葡萄糖

1000 ml蒸馏水、20.0 g琼脂（制备固体琼脂培养基时加入）

121 ℃高压灭菌15 min（葡萄糖溶液在灭菌后加入）

SD培养基

1.0 g Difco氮原(yeast nitrogen base, w/o amino acids）

12.0 g葡萄糖、0.50 g synthetic complete drop out mix

600 ml蒸馏水、10.0 g琼脂(Difco) (制备固体琼脂培养基时加入）

将各种试剂（琼脂除外）加入水中溶解，用10 mol/L NaOH调pH至5.6，121 °C高压灭菌15 min(葡萄糖溶液在灭菌后加入）

二、酵母质粒DNA的提取

A、接种酵母到10 ml YPD（yeast extract-peptonedextrose）液体培养基中，30 ℃下摇床培养过夜。

B、取5 ml培养物离心（2000 g，5 min）收集细胞。

C、细胞以0.5 ml山梨醇缓冲液（1 mol/L）悬浮，悬浮液转入另一离心管。

D、加入20 µl酵母裂解液（1 mol/L山梨醇缓冲液，含酵母裂解酶0.2~2 U/ml），37 ℃孵育1 h。

E、离心收集细胞（2000 g，1 min），弃上清。

F、细胞重悬于0.5 ml山梨醇缓冲液中。

G、加入10% SDS 50 µl，盖紧离心管盖，迅速颠倒混匀；65 ℃孵育30 min。

H、加入5 mol/L乙酸钾0.2 ml，冰浴1 h，4 ℃高速离心5 min去除细胞碎片。

I、室温将上清液转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇（室温）沉淀核酸（此步骤不要超过5 min）。

J、高速离心10 s回收沉淀的核酸，弃上清，沉淀物在空气中干燥10 min。

K、沉淀物重新溶解于300 µI TE （pH 8.0，含20 µg/ml RNA酶）中，37 ℃孵育30 min。

L、加入3 mol/L乙酸钠（pH 7.0）30 µl，混匀；加入0.2 ml异丙醇，混匀；高速离心20 s获得DNA。

M、弃上清，沉淀物在空气中干燥10 min。将DNA溶解于150 µl TE（pH 8.0）中备用。

三、酵母细胞外源DNA乙酸锂导入法（酿酒酵母）

A、接种酵母细胞于2~5 ml YPD或SD液体培养基中，30 °C摇床培养过夜。

B、接种于50 ml YPD培养基，细胞密度为5X10⁶/ml。于30 °C、200 r/min摇床中培养至细胞密度为2x10⁷/ml，转入50 ml灭菌离心管，3000 g离心5 min。

C、弃上清，用25 ml灭菌水重悬细胞并再次离心，弃上清。用1 ml 100 mmol/L LiAc 重悬细胞并将悬浮液转入1.5 ml微量离心管。

D、高速离心15 s沉淀细胞，用移液枪吸去上清。加入适量100 mmol/L LiAc重悬细胞，使其终体积为500 µl（细胞密度2X10⁹/ml,一般加入约400 µl 100 mmol/L LiAc）。

E、取待转化质粒溶液，煮沸5 min后立即置于冰上。

F、取50 µl细胞悬浮液至微量离心管，离心15 s，沉淀细胞并除去LiAc。

G、按如下顺序加入试剂，制备转化混合物：

灭菌水 34~X µ.,I

H、剧烈璇涡混合约1 min至沉淀细胞完全混合，30 ℃水浴30 min，42 ℃水浴热休克30 s。

I、6000 r/min离心15 s，小心吸去上清液，用1 ml灭茵水轻轻吹打以重悬细胞。

作为基因表达宿主，所用酵母必须具备下述条件：

①安全无毒，不致病；

②具有较清楚的遗传学背景，易进行基因操作；

③容易导入外源DNA；

④培养条件简单，容易进行高密度发酵；

⑤有较强的蛋白质分泌能力；

⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后修饰功能。