请教法夫酵母原生质体转化的具体方法。

首先利用Macerozyme（离析酶）降解叶片组织中的果胶物质，分离成单个细胞，然后利用Onozuka纤维素酶降解细胞壁，从而分离原生质体。

原生质体感受态制备方法包括：

1.去除法夫酵母多余的质粒或载体，通过 PCR 检测或酶切鉴定筛选转化株。

2.通过药物筛选筛选出感受态转化株。

3.通过酶切鉴定或测序鉴定来确定基因插入的位置和数量.

4.通过实验验证基因功能,如蛋白表达,酶学活性,生理活性等.

5.通过质粒分离和测序确定转化株的纯度。

这些感受态制备方法可以帮助确定转化株的纯度和基因插入的位置，确保转化株的高效性和准确性.

酵母感受态细胞的制备

1.在YPDA培养基上接种酵母AH109菌株。培养时间≤4周。菌落直径为2-3 mm、在15 mL离心管中加入3 mL新鲜的YPDA液体培养基、每个离心管中一个菌落、30℃， 250rpm、 8h。

2.吸取10μL种子菌加入到含有50 mLYPDA的250 mL三角瓶中、 30℃， 250rpm、 16-20 h。测OD600=0.15-0.3，将培养液移至50 mL离心管中。室温、 700 g 离心5min。

3.弃上清、用100 mLYPDA液体培养基重悬菌体、用500 mL三角瓶摇。 30℃。250rpm、 3-5h。

4.测OD600=0.4-0.5，将菌液分装到2个50mL离心管中。室温，700g离心5min。

5.弃上清。每管中加入30mL去离子超纯水、重悬菌体。 700g离心5min。

6.弃上清，用3 mL 1.1×TE/LiAc悬浮菌体、吸出分装到2个1.5 mL离心管中，12000 rpm 离心 15-30 s。

7.弃上清，每管中加入 600 uL 1.1xTE/LiAc 重悬菌体，备用。

注意:制备出的感受态必须马上使用。

二、酵母共转化

1.在1.5 mL离心管中加入、两种质粒各>200 ng

3-5μL已变性的鲑鱼精DNA100μL酵母感受态

600μL新配制的PEG/LiAc。轻轻混匀，可吸打、

2.30℃热板放置30min。每10min混匀一次。

3.加入70μL DMSO。缓慢混匀，caution。一定要缓慢、。

4.42℃热板热击20 min。每5 min缓慢摇匀一次、caution。一定要缓慢。。

5. 12000rpm离心15-30s，弃上清。

6.加入150μLYPDplus。 30℃热板放置30min或者30℃。 250rpm、 30 min。

7.12000 rpm 离心 15-30 s，弃上清。

8.用600μL0.9%。w/v， NaCl悬浮菌体。

9. 涂于二缺板

10.吸取5μL点在相应的缺陷平板上。每个组合按照10倍或5倍梯度稀释点2-4个点。

11.30℃培养2-3 d