酵母的高效转化

1、接种5ml液体YPAD或10ml SC,30℃下 振荡 培养过夜.

2、计数过夜培养物细胞密度,以最终5×106个/ml的细胞密度接种50ml YPAD培养液.

3、置30℃,200r/min振荡培养至2×107个细胞/ml,通常需要3～5小时,该培养物的细胞足够供十次转化用.

4、用50ml无菌离心管以3000g(2500r/min)离心5分钟,收获细胞.

5、弃培养液,把细胞悬浮在25ml无菌水中,再同上离心.

6、弃水,把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中,转悬浮物到一个无菌1.5ml 离心管 .

7、高速 离心 5秒钟沉淀细胞,用微量移液器吸出醋酸锂.

8、悬浮细胞到最终500μl体积其中大约含400μl的100mmol/L醋酸锂.

9、将1ml单链载体 DNA 样品煮沸5分钟,快速在冰水中冷却.

10、振荡细胞悬浮液,取50μl样品加到标记的离心管中,离心沉淀细胞,用微量取样器除去醋酸锂.

11、基本“转化混合液”由下列成分组成,小心按下列顺序如下：

240μl PEG(50% w/v)

36μl 1.0mol/L 醋酸锂

25μl 单链载体DNA(2.0mg/ml)

< p>

50μl 水和质粒DNA(0.1～10μg)

12、剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀,通常需要1分钟左右.

13、置30℃保温30分钟.

14、置42℃水浴中热激20～25分钟.

15、以6000～8000r/min离心15秒,用微量移液器除去转化混合液.

16、吸0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中,用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀.

17、用等份的200μl转化混合液涂选择平板.