毕赤酵母高效转化实验方案

毕赤酵母高效转化实验方案
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g 离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。
2.菌体处理
加入1ml处理液，室温下放置20min。
处理液：
10mM LiAc
10mM DTT
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.离心，弃上清，加入1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，
4.用1M sorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）
5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入 电击杯中，冰浴5min.
6.电转. 1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。
7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培养2h。
8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)

有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。