请教酵母转化，醋酸锂转化法相关问题
Wedllen
我是做酵母单杂交，用的酵母是EGY48，最近做了几次都没有转化成功，我是将两个质粒共转化至2缺培养基上培养二到三天后可以长出单菌落，最近做了几次，要么是培养基上长一些零星的小点点，要么干脆没有任何菌落，一次大概涂十个平板左右，有个别平板上长出了几个单菌落，挑了验了也是对的，现在遇到的是有一个质粒和他共转化的基因a基因b基因c。都没有长，所以我考虑是不是这个指令的问题，也重新用引物验了一下，亮度和位置也都没有问题，酵母也是用了活化之后的，最近这两次做的结果更是二缺平板上一个菌落都没有长，连小点点都没有，而且所谓的小点点挑了之后用二缺液体培养基摇也摇不起来。我用的是醋酸锂转化法。请教各位大神，现在应该如何排除问题，我已打算将质粒重新测序，酵母重新活化1-2次，另外这个质粒插入到多克隆位点处的GC含量很高，这个会对酵母转化有影响吗，卡在这里停滞住了，欢迎有经验的大神发表下见解，万分感谢
2 个回答
土井挞克树
以下为酵母醋酸锂转化法的步骤：
l.于5ml YPD液体培养基中接种酿酒酵母，300C下200rpm过夜振荡培养。
2.计数过夜培养的细胞密度，以5x106个／ml的最终细胞密度接种于50ml YPD培养液。
3.置300C条件下200 rpm振荡培养至细胞浓度为2x107个细胞_Jml，通常须要3．5小时，该培养物的细胞足够约可用于l0次醋酸锂转化。
4.离心，添加醋酸锂
loveliufudan
以下是一些建议来解决您的问题：
1. 转化体系优化：优化酵母转化实验条件，包括酵母细胞的处理和质粒的处理。确保酵母细胞处于最佳状态，例如使用新鲜活化的酵母细胞。此外，您可以尝试调整转化体系的pH、温度和转化缓冲液的配方，以提高转化效率。
2. 质粒验证：重新测序质粒以确保其序列正确性。可能存在质粒构建的问题，例如错误的序列插入或删除，导致表达的基因无法转化成功。
3. 多克隆位点和GC含量：高GC含量可能会对酵母转化效率产生一定影响。在插入到高GC含量的多克隆位点时，可能需要考虑优化转化条件或尝试其他位点进行插入。
4. 培养基和培养条件：检查您使用的培养基和培养条件是否适当。确保培养基成分正确，并且培养条件（如温度、气氛和培养时间）有利于酵母生长和转化。
5. 反复活化：尝试反复活化酵母，以确保其健康状态和最佳生长性能。
6. 阴性对照实验：进行阴性对照实验，排除转化缓冲液、培养基或其他试剂的问题。使用未经转化的酵母作为对照，检查培养基和条件对酵母生长的影响。
Wedllen
感谢答复，最近做的几次同样的条件有的二缺平板上是长出正确的单克隆的，只是对于这个质粒来说，和其共转化的二缺平板都没长，最近做的两次也有阳性对照，之前做出来过得又转化了一次，但是这两次做都是没长的，我已经在重新活化酵母，质粒重测序了，对于酵母的生长环境是没有问题的，之前也都是那样培养出来的，优化转化条件的话有点难于下手，还有就是高GC的问题，也只能插入到多克隆位点处
