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我想知道单纯针对法夫酵母原生质体制备完成后,载体转化入原生质体的方法
周末也要努力呀
1. 制备载体:将目标基因克隆到适当的载体上,例如质粒。
2. 转化酵母细胞:将制备好的载体转化入法夫酵母细胞中。有几种常用的方法可以实现转化:
- 钙离子法:将法夫酵母细胞与质粒混合,加入含有钙离子的转化缓冲液中,通过热冲击或电击使质粒进入细胞。
- 锂离子法:将法夫酵母细胞与质粒混合,加入含有锂离子的转化缓冲液中,通过热冲击或电击使质粒进入细胞。
- 冻融法:将法夫酵母细胞与质粒混合,经过冻融处理,使质粒进入细胞。
3. 选择转化子:将转化后的细胞接种在含有选择性培养基的平板上,只有带有转化质粒的细胞才能生长。
4. 验证转化:通过PCR、限制性酶切等方法验证转化是否成功。
。
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酵母感受态细胞的制备
1.在YPDA培养基上接种酵母AH109菌株。培养时间≤4周。菌落直径为2-3 mm、在15 mL离心管中加入3 mL新鲜的YPDA液体培养基、每个离心管中一个菌落、30℃, 250rpm、 8h。
2.吸取10μL种子菌加入到含有50 mLYPDA的250 mL三角瓶中、 30℃, 250rpm、 16-20 h。测OD600=0.15-0.3,将培养液移至50 mL离心管中。室温、 700 g 离心5min。
3.弃上清、用100 mLYPDA液体培养基重悬菌体、用500 mL三角瓶摇。 30℃。250rpm、 3-5h。
4.测OD600=0.4-0.5,将菌液分装到2个50mL离心管中。室温,700g离心5min。
5.弃上清。每管中加入30mL去离子超纯水、重悬菌体。 700g离心5min。
6.弃上清,用3 mL 1.1×TE/LiAc悬浮菌体、吸出分装到2个1.5 mL离心管中,12000 rpm 离心 15-30 s。
7.弃上清,每管中加入 600 uL 1.1xTE/LiAc 重悬菌体,备用。
注意:制备出的感受态必须马上使用。
二、酵母共转化
1.在1.5 mL离心管中加入、两种质粒各>200 ng
3-5μL已变性的鲑鱼精DNA100μL酵母感受态
600μL新配制的PEG/LiAc。轻轻混匀,可吸打、
2.30℃热板放置30min。每10min混匀一次。
3.加入70μL DMSO。缓慢混匀,caution。一定要缓慢。
4.42℃热板热击20 min。每5 min缓慢摇匀一次、caution。一定要缓慢。
5. 12000rpm离心15-30s,弃上清。
6.加入150μLYPDplus。 30℃热板放置30min或者30℃。 250rpm、 30 min。
7.12000 rpm 离心 15-30 s,弃上清。
8.用600μL0.9%。w/v, NaCl悬浮菌体9. 涂于二缺板。
10.吸取5μL点在相应的缺陷平板上。每个组合按照10倍或5倍梯度稀释点2-4个点。
11.30℃培养2-3 d。
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方法一:质粒转化,通过质粒转化方法将基因插入到酵母菌中。这种方法可以有效地提高转化率,但是需要配套的感受态制备方法.
方法二:集落转化,通过集落转化方法将基因插入到酵母菌中。这种方法可以获得高质量的转化株,但是需要配套的感受态制备方法.
方法三:环丝菌转化,通过环丝菌转化方法将基因插入到酵母菌中。这种方法可以获得高质量的转化株,但是需要配套的感受态制备方法.
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方法一:质粒转化,通过质粒转化方法将基因插入到酵母菌中。这种方法可以有效地提高转化率,但是需要配套的感受态制备方法.
方法二:集落转化,通过集落转化方法将基因插入到酵母菌中。这种方法可以获得高质量的转化株,但是需要配套的感受态制备方法.
方法三:环丝菌转化,通过环丝菌转化方法将基因插入到酵母菌中。这种方法可以获得高质量的转化株,但是需要配套的感受态制备方法.
配套的感受态制备方法包括:
1.去除多余的质粒或载体,通过 PCR 检测或酶切鉴定筛选转化株。
2.通过药物筛选筛选出感受态转化株。
3.通过酶切鉴定或测序鉴定来确定基因插入的位置和数量.
4.通过实验验证基因功能,如蛋白表达,酶学活性,生理活性等.
5.通过质粒分离和测序确定转化株的纯度。
这些感受态制备方法可以帮助确定转化株的纯度和基因插入的位置,确保转化株的高效性和准确性.