【专题讨论】杆状病毒——昆虫细胞蛋白表达系统，影响蛋白表达的因素？
丁香园论坛
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不知道有多少人成功用杆状病毒——昆虫细胞表达系统成功进行过蛋白表达？我最近表达一段病毒的非结构蛋白nsp-6，构建的重组Bacmid质粒经PCR鉴定正确，可是进行表达时，却未见蛋白表达，同时进行的试剂盒对照（含CAT基因的重组细胞中则有较好的表达。
我听说约有70%的蛋白在原核表达系统中是不表达的，但不知道这样的情况会不会发生在我用的昆虫细胞表达系统，除了实验操作失误方面的原因，还有什么因素是不使蛋白表达的，请大家讨论一下。
下面是我的实验过程，请高手指教，同时希望也给新手一个指导吧（我使用的是Invitrogen的产品，具体说明书大家可以参照Invitogen操作手册http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf）：
The genes of nsp-6 was cloned into BamHI and EcoRI sites of the pFastBac HTA vector, then the ligation reaction was transformed into DH10B and selected for ampicillin-resistant transformants (LB plates, ampicillin 100μg/ml); The constructed pFastBac vector was transformed into DH10Bac E.coli for transposition into the bacmid, blue/white selection was used to identify colonies containing the recombinant bacmid and the bacmid was also analyzed by PCR with the M13 primers. Once the recombinant bacmid was confirmed, it was ready to transfect insect cells.
Sf9 were maintained in TNH-SFM complete medium。
抱歉该段未翻译成中文。
实验材料：
1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自 Roche。
实验步骤：
一、 昆虫细胞转染：
1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2． 准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：
a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3． 重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4． 取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5． 移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、 病毒贮液的制备：
1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：
感染所需病毒贮液量(ml)=
[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]
注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：
a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。
c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。
d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。
三、 病毒贮液初步鉴定
1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。 CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。
2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。
3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA试剂和说明书。
结果
1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细胞中。
2. 蛋白电泳和免疫印迹均看见对照his-CAT蛋白表达，但不见我想表达的非结构蛋白his-nsp-6。
在接下来的这段时间里，一直在进行条件的摸索，现在把这段时间的结果报告一下：
1. 利用细胞DNA提取试剂盒提取感染细胞的DNA，用针对目的基因的特异性引物以PCR的方法鉴定，发现结果呈阳性，表明该质粒成功转染，但为何不表达，仍需摸索。
2.根据上述结果，在后续的实验当中发现用感染的细胞涂片，使用特异性针对目的蛋白的抗体做免疫荧光鉴定，发现呈阳性，这一点证实转染的质粒成功且有蛋白表达，问题是为什么表达量如此低，以至于免疫印迹检测不出来？
下一步将要进行的工作是，摸索如何提高蛋白表达量的方法，使用空斑纯化获得较纯的病毒不知道能不能提高蛋白表达量？这一点，也请有经验的站友给与指导，谢谢！
我听说约有70%的蛋白在原核表达系统中是不表达的，但不知道这样的情况会不会发生在我用的昆虫细胞表达系统，除了实验操作失误方面的原因，还有什么因素是不使蛋白表达的，请大家讨论一下。
下面是我的实验过程，请高手指教，同时希望也给新手一个指导吧（我使用的是Invitrogen的产品，具体说明书大家可以参照Invitogen操作手册http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf）：
The genes of nsp-6 was cloned into BamHI and EcoRI sites of the pFastBac HTA vector, then the ligation reaction was transformed into DH10B and selected for ampicillin-resistant transformants (LB plates, ampicillin 100μg/ml); The constructed pFastBac vector was transformed into DH10Bac E.coli for transposition into the bacmid, blue/white selection was used to identify colonies containing the recombinant bacmid and the bacmid was also analyzed by PCR with the M13 primers. Once the recombinant bacmid was confirmed, it was ready to transfect insect cells.
Sf9 were maintained in TNH-SFM complete medium。
抱歉该段未翻译成中文。
实验材料：
1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自 Roche。
实验步骤：
一、 昆虫细胞转染：
1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2． 准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：
a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3． 重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4． 取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5． 移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、 病毒贮液的制备：
1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：
感染所需病毒贮液量(ml)=
[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]
注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：
a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。
c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。
d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。
三、 病毒贮液初步鉴定
1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。 CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。
2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。
3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA试剂和说明书。
结果
1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细胞中。
2. 蛋白电泳和免疫印迹均看见对照his-CAT蛋白表达，但不见我想表达的非结构蛋白his-nsp-6。
在接下来的这段时间里，一直在进行条件的摸索，现在把这段时间的结果报告一下：
1. 利用细胞DNA提取试剂盒提取感染细胞的DNA，用针对目的基因的特异性引物以PCR的方法鉴定，发现结果呈阳性，表明该质粒成功转染，但为何不表达，仍需摸索。
2.根据上述结果，在后续的实验当中发现用感染的细胞涂片，使用特异性针对目的蛋白的抗体做免疫荧光鉴定，发现呈阳性，这一点证实转染的质粒成功且有蛋白表达，问题是为什么表达量如此低，以至于免疫印迹检测不出来？
下一步将要进行的工作是，摸索如何提高蛋白表达量的方法，使用空斑纯化获得较纯的病毒不知道能不能提高蛋白表达量？这一点，也请有经验的站友给与指导，谢谢！
