CHO细胞表达系统研究进展

影响外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的因素很多，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻译和翻译后等各级水平，其中mRNA的转录是真核基因表达谓节的基本控制点，它的翻译对表达水平也有一定作用。

研究表明，所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关，主要是通过载体构建基因转染方法和选择不同标记来调控。而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构来实现。

转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis acting element)与反式作用因子(trans-acting factor)的相互作用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此，表达载体的元件组成及结构是ClIO细胞高效表达外源基 因的关键因素之一。

借助真核基因表达调控的理论，可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便而高效地用于外源基因的表达。 目前在这一理论指导下，已经构建了许多来源于细菌质粒的表达载体，它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件 主要有启动子一增强子元件、转录剪切和Poly A信号等。

1、启动子

启动于是影响外源基因表达效率的关键因素因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报告基因在细胞中测定。

SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。刘文军等比较了SV40、LTR和CMV在ClIO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子>LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。

来源于噬菌体的一些启动子，如17启动子也可用于动物细胞。17启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。除了这些常用的启动子之外，还有多种强的启动子被用于CHO细胞表达载体中。

如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启动子等在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。改变CMV和AdMLP之后EPO基因的前导序列，使CHO细胞表达EPO的水平增加了2l倍和l6倍。

在实际应用中所有的生产细胞系都是用强的、组成 型启动子。SR启动子(SV40早期启动子+HTLV)比SV40早期启动子表达水平提高约5倍。

与启动子相连的是增强子元件，也是一种调节基因转录的顺式作用元件，具有种和组织特异性。

病毒增强子的主要优点是病毒包装要求增强子位于mRNA帽子位点附近，从而形 成紧密型表达载体CHO细胞中一般使用SV40和CMV增强子。增强子可位于载体中两个启动子之间，为两个启动子公用。

2、外源基因

位于启动子之后的是克隆的基因序列，或被表达的外源蛋白的cDNA。外源基因的结构 可在翻译水平上调控它的表达效率，这种调控机理很复杂，目前尚不清楚。但是在启动子一定的情况下，可以通过下列方法增加外源基因的表达量：

①在加工和剪接途径中引入一个指导前体mRNA合成的内含子序列；

②引入一个促进mRNA翻译的序列；

③拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌物和膜结合蛋白的输出等；

④在不改变基因产品氨基酸序列的前提下修饰个别基因的编码序列，解决密码子偏性问题；

⑤尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5未翻译前导区和克隆中的GC尾部对表达水平的不良影响，以及减少3未译区(3-UTR)对mRNA稳定性的不良影响。例如，人G-CSF基因的3-UTR中富含AT元素（ARE)，ARE与mRNA 的半衰期有关，切除AR以增加mRNA的稳定性，提高蛋白质的合成；

⑥转染靶细胞中导人表达载体启动子相应的强反式激活因子是提高外源基因表达的新策略。

3、终止区域

为了使外源基因得到准确表达，其后是强的终止子区域。终止子一般从病毒基因组，如 SV40、T抗原终止信号、肝炎表面抗原序列或β-珠蛋白等中获得。不同的3'-未编码区(UTR)序列能影响重组系统的表达。Rotondaro等使用两个不同的3'-未翻译区表达人G-CSF，结果包含兔β1-珠蛋白基因第二内含子和聚腺苷酸信号的3'-UTR的表达效率高于包含SV40小t内含子和早期区域腺苷酸化信号的3'-UTR的表达效率。

4、选择标记

要从细胞中选择出获得了外源DNA并稳定转化的动物细胞是很困难的。为此，人们在表达质粒或另一个质粒上，克隆或构建了许多选择性标记。目前有十余种选择性标记可供使用。最常使用的有DHFR、Neo和GS等基因。为了便于过程分析，研究者们还在CHO细胞中构建了一些具有特殊物理性质的报告基因。如Trudy H等人将E.coli Lac z基因克隆到载体上，通过简单的比色实验便可快速测定出β-半乳糖苷酸的活性，细胞在无菌条件下分析后还可继续培养。分泌碱性磷酸酶的基因也有类似的功效。其它类型的报告基因在检测时不甚便利，因为它们或者要求放射性基质，或者要求特殊仪器以测定发光物质或荧光物质。

5、基因扩增

外源基因在哺乳动物细胞内的扩增是提高外源基因表达水平的重要策略之一。一般来讲，表达系统中的整个载体是由两个独立且连在一起的表达单元组成：外源基因表达单元和 扩增基因表达单元。扩增基因往往亦为选择标记。

迄今为止，世界上已经建立了十余种基因扩增选择系统，其中二氢叶酸还原酶(dhfr)基因扩增系统是最常用的基因扩增选择系统。而谷氨酰胺台成酶(GS)扩增系统是新近发展的更有效的扩增表达系统。宿主细胞为CHO-k1细胞。

在这个系统中质粒pEEl4被整合人染色体，使外源基因在人巨细胞病毒(h-CMV5)和 SV40 3'-端控制下进行表达。选择标记基因是从SV40晚期启动子转录而来，其中包括一个小基因，一个内含子和3'-侧翼约lkb DNA。GS基因的选择压力是低水平的MSX，在这一选择压力下．细胞内的外源基因拷贝数可达1000-2000拷贝/细胞。GS基因扩增前后，CAT基因的表达水平提高了19-20倍左右。与dhfr基因扩增系统相比，GS系统具有更高的扩增效率。Bebbinglon等人利用GS系统生产嵌合抗体，表达水平达200-500mg/106/48h。