CHO细胞表达系统研究进展

影响外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的因素很多，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻译和翻译后等各级水平，其中mRNA的转录是真核基因表达谓节的基本控制点，它的翻译对表达水平也有一定作用。

研究表明，所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关，主要是通过载体构建基因转染方法和选择不同标记来调控。而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构来实现。

转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis acting element)与反式作用因子(trans-acting factor)的相互作用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此，表达载体的元件组成及结构是ClIO细胞高效表达外源基 因的关键因素之一。

借助真核基因表达调控的理论，可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便而高效地用于外源基因的表达。 目前在这一理论指导下，已经构建了许多来源于细菌质粒的表达载体，它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件 主要有启动子一增强子元件、转录剪切和Poly A信号等。

1、启动子

启动于是影响外源基因表达效率的关键因素因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报告基因在细胞中测定。

SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。刘文军等比较了SV40、LTR和CMV在ClIO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子>LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。

来源于噬菌体的一些启动子，如17启动子也可用于动物细胞。17启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。除了这些常用的启动子之外，还有多种强的启动子被用于CHO细胞表达载体中。

如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启动子等在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。改变CMV和AdMLP之后EPO基因的前导序列，使CHO细胞表达EPO的水平增加了2l倍和l6倍。

在实际应用中所有的生产细胞系都是用强的、组成 型启动子。SR启动子(SV40早期启动子+HTLV)比SV40早期启动子表达水平提高约5倍。

与启动子相连的是增强子元件，也是一种调节基因转录的顺式作用元件，具有种和组织特异性。

病毒增强子的主要优点是病毒包装要求增强子位于mRNA帽子位点附近，从而形 成紧密型表达载体CHO细胞中一般使用SV40和CMV增强子。增强子可位于载体中两个启动子之间，为两个启动子公用。

2、外源基因

位于启动子之后的是克隆的基因序列，或被表达的外源蛋白的cDNA。外源基因的结构 可在翻译水平上调控它的表达效率，这种调控机理很复杂，目前尚不清楚。但是在启动子一定的情况下，可以通过下列方法增加外源基因的表达量：

①在加工和剪接途径中引入一个指导前体mRNA合成的内含子序列；

②引入一个促进mRNA翻译的序列；

③拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌物和膜结合蛋白的输出等；

④在不改变基因产品氨基酸序列的前提下修饰个别基因的编码序列，解决密码子偏性问题；