病毒灭活试验——低 pH 孵放技术

低 pH 孵放技术是一种病毒灭活方法，适用于水痘疫苗、流感疫苗等多种病毒。该方法通过降低 pH 值和提高温度来灭活病毒，从而保证疫苗的安全性。

该方法本质是在病毒颗粒中缓慢地增加固定的低 pH 值，引起其结构的改变和失活。在体外的情况下，病毒普遍不能耐受灭活过程中降低 pH 值，高温等条件，因此通过该实验方法可以实现对病毒颗粒的安全灭活。

病毒灭活是制备活疫苗或不活疫苗的一种重要手段。该实验方法可以用于制备水痘疫苗和流感疫苗，确保疫苗的安全性和有效性。

① 病毒悬液

② 0.1mol/L NaH₂PO₄

③ NaCl

④ 0.1mol/L PBS

⑤ 马来酰亚胺哌嗪（MOPS）

⑥ 低温冰箱

⑦ 微孔板

⑧ 无菌平板

⑨ 硫酸铵

⑩ 酚红指示剂

⑪ 手套、口罩、护目镜等安全护具

1、准备实验环境：工作区表面清洁干净，排除任何可能造成样本受污染的因素。

2、穿戴安全护具：戴上手套、口罩、护目镜等安全护具，避免病毒样本的直接接触。

3、准备样本：将病毒样本从储存容器中提取，并将其加入 1.5 ml 离心管中。

4、加入磷酸盐缓冲液：向病毒样本中加入足够的 PBS 缓冲液，将其浓度调至期望的稀释度。

5、溶于低 pH 缓冲液中：将病毒样本与 PBS 缓冲液的混合物彻底溶于低 pH 缓冲液中，搅拌均匀。

6、孵育：设置一个适当的孵化时间、温度和低 pH 值，以保证病毒样本在低 pH 条件下被灭活。「通常情况下，使用 pH 4.0 的可溶性吡啶可在短时间内有效孵放」（根据不同实验需要孵放时间以实验为准）。

7、调节 pH 值：在孵化时间结束后，迅速用梁氏缓冲液或其它可以中和低 pH 的缓冲液调节样本的 pH 值。

8、孵化对照组：在同样的温度下，将一部分病毒样本用磷酸盐缓冲液进行孵化，不加低 pH 缓冲液，作为对照组。

9、氧化还原剂处理：可以使用过氧化氢或电子束灭活等方法进一步确认病毒已经被灭活。

10、检测样本灭活病毒是否被完全灭活，若灭活未彻底可以修改实验条件重新实验（例如，调整孵育时间、低 pH 浓度）。

1. 实验操作时必须穿戴完善的安全护具。

2. 实验环境须严格按照生物安全规定设置，以保证实验操作过程及结束后的环境安全。

3. 实验器材必须预先消毒，避免外来物质污染病毒样本。

4. 在操作过程中，避免采用模糊不清的缓冲液混合物，以免在低 pH 缓冲液中出现沉淀。

5. 整个过程应在大型生物安全实验室中进行，以确保完成病毒的灭活及外泄风险的降低。

1. 如何确定每个实验的 pH 适宜值? 

一般根据病毒样本适应的范围来选择以及前期的实验推算；

2. 低 pH 溶液使用的越浓病毒灭活效果越好吗？

不尽然，低于 5.5 的低 pH 缓冲液对病毒的灭活是一种相对慢速的过程，较高的浓度可能需要过长时间的孵育, 同时还可能使病毒样本性质遭受破坏，同时也极易在操作的过程中生成沉淀，最终导致实验失败。