病毒灭活试验——纳米膜过滤技术

纳米膜过滤技术根据分子筛原理，利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔径的蛋白通过滤膜，大于平均孔径的病毒截留在膜内，从而达到去除病毒的效果。根据目的蛋白的大小，可以选择平均孔径不同的滤膜。

纳米膜过滤可以同时满足病毒去除效果好、目的蛋白质通过性高（回收量、过滤时间）、目的蛋白质不变性的特点，另外不管是脂包膜病毒还是非脂包膜病毒，无论病毒基因组是RNA还是DNA，基本靠孔径大小来去除病毒，所以是当前最可靠的病毒去除、灭活技术。

与常规过滤不同，该过滤技术采用膜的平均孔径为纳米级别，且专为去除病毒而开发。

纳米膜、预过滤膜

1、纳米膜使用前完整性测试：将纳米膜过滤器一端连接气源，另一端连接排水管，排出纳滤膜丝内的液体。将排水出口端封闭，若未观察到有连续气泡产生，则纳滤膜使用前完整性测试合格。

2、制品的纳米膜过滤：将预过滤膜依次过滤注射用水及缓冲液（250 mmol/L甘氨酸，pH 3.93）各 200 mL，1000 mL 样品加入后分别进行预过滤后再进行纳米膜过滤；

当下游出现第1滴纳滤样品时开始计时并称重，前 15 min，每 1 min 记录 1 次，之后每 5 min 记录 1 次至 60 min，每 10 min 记录 1 次至 120 min，每 30 min 记录 1 次至滤速降低到开始滤速的 1%，终止过滤。每滤出 10 mL 记为 1 个样品（放室温 20 h 后于 -30 ℃ 冻存备用）。

3、称重法确定滤出液质量：蛋白过滤总量 = 过滤总量W / 过滤面积 × 纳滤前蛋白浓度 C。

4、蛋白过滤速度：蛋白过滤速度 = W△t / 过滤面积 / △t × 60 × 纳滤前蛋白浓度 C。△t 为相邻两个过滤时间的差，W△t 为相邻两个过滤时间 t 对应过滤总量的差。各变量所采用的单位为： W（g） 、W△ t（g） 、t（min） 、C（mg/mL）

1. 针对不同蛋白样品选择不同的滤膜材质。

2. 除病毒压力通常为 2~3 Bar。压力过高可能影响病毒去除效果，压力波动情况下可能会造成病毒穿透。

3. 蛋白质浓度过高易发生积聚阻塞膜从而影响过滤效果。

4. 一般重组蛋白的过滤时间在 6 小时以内，血液制品过滤时间在 12 小时以内。

1. 蛋白过滤效果差。

答：样品蛋白质浓度太低，需要抽滤进行富集；蛋白质浓度过高，发生积聚阻塞膜影响过滤效果，要选择合适的蛋白浓度。

2. 为什么要进行小试载量试验？

答：不同蛋白质、不同的除病毒过滤器，蛋白质载量差异较大。蛋白性质决定选择什么样的膜材质。

3. 为什么有时候过滤速度非常慢？

答：蛋白质可能产生了气泡，要先去除气泡。