细菌生化试验——石蕊牛奶试验

一、试验原理

石蕊既是 pH 指示剂，又是氧化还原指示剂，在酸性溶液（pH 4.5）呈红色，在碱性（pH 8.3）呈蓝色，培养基本色应为紫蓝色（pH 6.8）。石蕊又可被某些细菌还原成无色母体。

牛奶含有乳糖和三种主要蛋白质，即酪蛋白、乳蛋白和乳球蛋白。

引起牛奶凝固主要是细菌含有凝乳酶，它可使酪蛋白转化成副酪蛋白，或因乳糖发酵产生大量酸使酪蛋白沉淀所致。

有些细菌产生脂酶，可分解牛奶中的脂肪，形成黄色透明液体。

有些细菌具有酪蛋白水解酶，可催化酪蛋白水解，最终转化成透明液体的酪蛋白原沉淀物，这个过程称为蛋白胨化。

二、培养基

脱脂奶粉 100.0 g

石蕊 适量

水 1000.0 mL

将奶粉充分溶化于水中，调至 pH 6.8，加入石蕊溶液直到呈现紫蓝色（pH 6.8），分装试管，每管约 5 mL。于 115℃ 灭菌 10 min，迅速冷却，放冰箱中备用。

石蕊溶液配制法：称取石蕊 2.5 g，放入钵中研碎，移放于盛有 40% 乙醇水溶液 50 mL 的烧瓶中，煮沸 1 min，静置约 10 min，吸取上清液移入另一烧瓶中，再加 40% 乙醇水溶液 50 mL 于原烧瓶中，再煮沸 1 min。

将上清液加于前上清液中，将两次上清液混合均匀，离心沉淀，将上清液倒入 100 mL 量筒中，用 40% 乙醇补至 100 mL，滴加 1 M 盐酸直至溶液呈现紫色，即为 2.5% 石蕊溶液。

95% 乙醇 42.1 mL 加水至 100 mL 即为 40% 乙醇溶液。

三、试验方法

以待试菌 18~24 h 培养物接种，若为厌氧芽孢杆菌，应在培养基管中加入无菌铁屑或铁钉等，并加无菌凡士林等覆盖，置 36±1℃ 培养 1-14 天。

四、试验结果判断

1. 粉红色：乳糖被发酵产酸；

2. 紫蓝色：乳糖为被发酵，保持原色；

3. 蓝色：碱性反应，乳糖为被发酵，细菌分解培养基中含氮物质，产生碱性物质；

4. 白色：石蕊被还原；

5. 澄清：牛奶蛋白被消化（胨化）；

6. 凝块会成凝乳：因大量产酸，牛奶蛋被被凝固；

7. 产气：乳糖被分解产酸产气，强烈发酵可破坏凝块。

五、说明

如无脱脂奶粉，可将新鲜牛奶放冰箱过夜，除净上面的奶油层，将脱脂奶置于流动蒸汽加热灭菌 1 h，冷却到小于 10℃，以灭菌纱布过滤，加石蕊溶液至淡紫色为止，分装试管，灭菌同前。

作者：张辉

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