重组子的检测

[ 实验目的 ]

通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。

通过本实验学习重组质粒的检测技术。

[ 基本原理 ]

聚合酶链反应（ polymerase chain reaction ， PCR ）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种技术。在待扩增的 DNA 片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后， DNA 扩增 2 n 倍。

PCR 进行的基本条件是：

（ 1 ）以 DNA 为模板（在 RT － PCR 中模板是 RNA ）；

（ 2 ）以寡核苷酸为引物；

（ 3 ）需要 4 种 dNTP 作为底物；

（ 4 ）有 Taq DNA 聚合酶。

PCR 每一个循环由三个步骤组成：

（ 1 ）变性　　加热模板 DNA ，使其解离成单链；

（ 2 ）退火　　降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板 DNA 所需扩增序列结合；

（ 3 ）延伸　　在适宜温度下， Taq DNA 聚合酶利用 dNTP 使引物端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的 DNA 链。

每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过 35 个循环后，目标 DNA 片段可能性扩增可达 2 35 倍。

[ 器材 ]

1 ． PCR 扩增仪 2 ．掌式离心机 3 ． 0. 2ml PCR 管

[ 试剂 ]

1 ． Taq DNA 聚合酶

2. 10×PCR 反应缓冲液

3. 2. 5 mmol/L dNTP

4. 50 mmol/L MgCl 2

5. 模板 DNA

6. 上游引物

7. 下游引物

8. 标准 DNA

[ 实验步骤 ]

1. 以质粒 DNA 为模板进行 PCR 扩增。 PCR 反应总体积为 20 μl ，反应液组成：



2. PCR 反应程序设定为： 94℃ ，预变性 5 min ； 94℃ 变性 1 min ， 66℃ 退火 30 s ， 72℃ 延伸 1 min ；共进行 35 个循环；最后 72℃ ，延伸 10 min 。

3. 扩增完毕，取 10 μL 用 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果。