免疫PCR

主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验（ELISA）的测定过程；第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素（Protein A-Streptavidin）嵌合体（重组融合蛋白）中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19（质粒DNA) (Biotin-pUC19）中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。
 

PCR由以下五部分构成：
（1）待测抗原；
（2）生物素化抗体；
（3）亲和素（连接分子）；
（4）生物素化DNA；
（5）PCR扩增。

一、制备生物素化DNA
 

将噬粒 BLuescript skt，用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280 bp DNa段，即为生物素化DNA。
 

二、免疫PCR模式
 

1.  试剂
 

包被缓冲液：20 mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150 mmol/L NaCl和0.02%NaN₃；
 

洗涤液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/LNaCl 0.1 mmol/L EDTA和0.1%Tween20；
 

稀释液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/L NaCl 0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA （0.1 mg/ml）。
 

2.  操作
 

（1） 包被
 

用包被缓冲液稀释抗原（BSA），加入微滴板中（45 μl孔），4℃过夜（约15 h），用洗涤液洗板3次×5 min。
 

（2） 封闭
 

每孔加200 μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA（1 mg/ml）、0.1 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150 mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80 min，洗板数次。
 

（3） 抗原抗体反应
 

用释释液1:8 000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50 μl，室温（22℃）下45 min，洗板孔15次×10 min，去除未结合的抗体分子。
 

（4） 链亲合一蛋白A结合反应
 

每孔加入50 μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温（22℃）50 min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10 min，再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。
 

（5） PCR
 

实验条件 50 mmol/L KCI、10 mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5 mmol/LMgCl₂、明胶（10 μg/ml）、0.8 mmol/LdNTPs（每种0.2 mM）、2 μM引物（每一引物1 μM）和TaqDNA多聚酶（50 U/ml）。
 

三、PCR周期
 

PCR前，用紫外线（UV）（254 nm）照射上述反应混合物，然后将之加入到微滴板孔中，每孔40 μl，再加20 μl UV照射的石蜡覆盖，按下述温度在PCR仪上进行PCR周期：起始变性94℃5 min；30个周期：变性94℃5 min，退火58℃1 min，延伸72℃1 min，最后延伸72℃ 5 min，得到的PCR产物为特定的261 bp的片段。
 

1.  用0.85% NaCl将细菌溶液稀释至一定浓度；
 

2.  加50 μl于微孔板内，4℃过夜。同时设阴性对照（加50 μl 0.85% NaCl于另一孔内）；
 

3.  用400 μl的0.05% 温20pBS（以下简称TPBS），洗涤五次；
 

4.  加入2.25%的100 μl正常山羊血清（NGS） PBS封闭2小时；

⒌  用含0.15% NGS的TPBS洗3次；

 

6.  加入100 μl用0.75% NGS适当稀释的单克隆抗体（内含100 μg的鲜鱼精DNA），室温孵育30 min；
 

7.  用TPBS洗涤五次；
 

8.  加入50 μl适量稀释的生物素化抗鼠IgG抗体，室温孵育30 min；
 

9.  用TPBS洗涤五次；
 

10.  加入60 μl适量稀释的生物素化DNA和亲和素，室温孵育30 min；
 

11.  用TPBS洗涤五次，再用HPLC级水洗三次；
 

12.  PCR扩增：加入50μl PCR反应液（内含T3和T7引物），95℃ 60 s，50℃ 110 s，72℃ 110 s，循环30次。取PCR产物10 μl于1.7%琼脂糖凝胶上电泳，和核酸分子量标准相比较，在相应的位置邮现电泳带为阳性。必需时将电泳结果照像，进行定量分析。

 

一、发展
 

免疫PCR技术目前尚处于研究阶段，还没有一个十分成熟和满意的方法，配套试剂尚缺乏，所以应用的还不多，在报道的几种方法中均是用一些已知的标准品进行试验。Sano，Ruzicka和Hong zhou分别用牛血清白蛋白、小鼠IgG和重组人原癌基因产物ETS；蛋白作为待检抗原进行免疫PCR，他们的结果均表明免疫PCR的敏感性比ELISA高105倍，且PCR产生的背景信号很弱，可以检测到几百个分子的抗原，在理论上免疫PCR可以检测到一个分子抗原，因此，免疫PCR特别适用于检测一些含量特别少的抗原分子。目前介绍的免疫PCR还存在一些缺点，在报道的文献中均采用待检抗原直接吸附固相，这样固相的均质性必然对结果有很大的影响；同时检测的样品液中其它成分也可以吸咐固相，极易产生背景过高或精确度下降。另外，有些难于吸咐固相的抗原也就不能用免疫PCR检测，连接分子的特异性和均质性对PCR影响很大，从理论上看Hong zhou的生物素标记抗体和DNA以及用游离的链亲和素连接抗体和DNA是一比较理想的方法，但是如能做到生物素化抗体、亲和素和生物素化DNA3个分子预先连接一个复合物，那么将简化实验过程。PCR扩增过程相对简单，如用微量板作为固相需选用配套的PCR仪，否则需将其移入反应管内，这必然导致很大的误差，经放大可产生显著差异。固相也可以直接采用某些PCR反应管，并且可以直接用一般的PCR仪进行扩增，但冲洗过程相对复杂一些。免疫PCR具有非广泛的应用前景，十分有必要进一步完善免疫PCR的实验过程和配套试剂的研制。
 

二、应用
 

荧光PCR是分子诊断的热点技术，它将先进的定量PCR与实时PCR技术相结合，西安天隆生产的国产实时荧光定量PCR仪为肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸检测及分子诊断、同时也为沙门氏菌阪崎氏肠杆菌等食品安全检测提供了先进手段。即使在发达国家，荧光定量PCR仪和基因扩增仪都被广泛用于临床及生物学、医学研究。由于其极高的灵敏度、极宽的检测范围，以及精确定量、方便快速、无窗口期等优点，美国FDA及中国国家标准已将定量PCR仪规定为确诊禽流感等传染病以及奶粉等食品安全检测的必备仪器。