免疫PCR系列二-免疫PCR的种类

（1）原位免疫PCR（in situ immuno,PCR）

原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，是一种原位检测组织或细胞中抗原的技术。它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。

原位PCR是Hasse等于1990年建立的，实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。

其基本方法为

① 固定组织或细胞：将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶。

②蛋白酶K消化处理：用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K。

③PCR扩增：在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增。有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置。

④杂交：PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交。

⑤显微镜观察结果。

待检石蜡切片上的非特异性结合位点经过充分封闭，内源性DNA和RNA经核酶充分消化后，通过生物素化单抗与亲和素系统的桥联.

将生物素化的DNA报告分子固定在石蜡切片上，进行原位PCR扩增，扩增产物经原位核酸杂交，以杂交信号指示待测抗原是否存在。Cao用原位免疫PCR检测肝石蜡切片上的乙肝表面抗原（HBsAg），其敏感性较免疫组化法显着提高。

原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。其特异性和敏感性高于一般的PCR。

（2）细胞免疫PCR（cellular immuno,PCR）

通常用来检测细胞表面膜抗原。Zhang用此法成功的检测了白血病病人血清中转移癌细胞上的肿瘤抗原GM3.

首先用抗CM3单抗制备单抗-亲和素-生物素化复合体，然后分离病人外周血淋巴细胞，充分洗涤封闭后，与单抗DNA复合体共育，洗涤后抽提细胞总DNA,利用DNA报告分子的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经Southern-blot显示结果，病人外周血淋巴细胞可扩增出300bp的特异性条带，正常人无。

（3）多分析物免疫PCR

利用大小不同的DNA分子标记不同的抗体，可同时检测多种抗原。Joerger用99个碱基的DNA分子标记hCG抗体，用88个碱基的DNA分子标记hT-SH抗体，同时检测hCG、hTSH两个分析物，两个DNA报告分子共用一对引物，但PCR产物的分子量不同，从而使两个抗原得以鉴别。

（4）单引物免疫PCR

即DNA报告分子的两侧累含有相同的引物序列，可用单引物进行PCR扩增。该法可提高PCR扩增效率，且适合于多分析物免疫PCR。