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科研学霸天团，48小时有问必答

问求大神指点HOK细胞怎么培养

bamboopiggy

HOK细胞是帖壁细胞，用89%H-DMEM+10%FBS+1%双抗养就可以。但是细胞对消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞完全漂浮。混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。

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问请问我提了牙龈成纤维细胞原代，传代时候一直在培养基中加双抗，现实验需要去除双抗干扰，但是细胞一换成无双抗培养基就死怎么办？

bamboopiggy

是因为污染么？一停双抗细胞就污染了？你要去双抗的目的是什么呢？转染？其实现在好多转染试剂毒性没有那么大，不一定非要去除双抗。

3 回答794 围观

问提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰， DNA质量一直不高，如何消除多糖的影响？

迟C迟

可以买商业化的试剂盒，针对多糖含量高的植物样本的。

3 回答250 围观

问能否用本试剂盒提取酵母中的基因组DNA？

bamboopiggy

您所谓的本试剂盒，是哪个试剂盒啊？一般能提取细胞和组织的genomic DNA的试剂盒，可以用来提取酵母的genomic DNA

3 回答162 围观

问提取的DNA中有RNA污染，为什么？

bamboopiggy

你提取DNA的buffer里面，第一步重选细胞的液体里面有没有加RNase？需要加RNase的

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问提取的基因组DNA生物活性差，为什么？

bamboopiggy

你用基因组dna来做，可能量比较低，最好把你需要测活性的那个片段克隆出来做。

3 回答88 围观

问提取的基因组DNA有降解，为什么？

bamboopiggy

你是不是裂解细胞的时间长了，把genomic dna一起裂开了？建议优化一下裂解时间。

3 回答86 围观

问质粒dna提取失败原因是什么

Keven轩

一般按照试剂盒来都没有问题，没提出来可能是质粒根本没转进去，或者操作问题

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问DNA ladder能当marker使用吗

bamboopiggy

DNA ladder就是marker啊，不同的地方叫法不一样而已。

3 回答77 围观

问提基因组DNA的时候脂肪过多，怎么去掉呢

bamboopiggy

裂解细胞以后，将小心将脂肪层下面的液体吸出，再进行提取

3 回答83 围观

问请问原代培养的细胞转染需要注意什么?

天一湖医者

1.细胞接种：一般做转染前一天接种/铺板（细胞计数大约5*10^4cell/ml），使做转染前细胞密度在30-50%；如果细胞是原代细胞，接种密度可以密一些，细胞计数在2*10^6cell/ml；悬浮细胞可以在转染当天接种/铺板（细胞计数大约5*10^4cell/ml），待细胞状态稳定后做转染前细胞密度30-40%。2.为了能在使用时有较好的转染效果，第一次使用建议您用24孔板做，每孔2ul转染试

4 回答158 围观

问因为疫情原因血清和双抗在4℃放了近30天，请问还能用吗？

迟C迟

现在一般商业化的血清和双抗都比较稳定，4℃30天一般问题不大。

4 回答253 围观

问DNA提取后出现一系列的絮状沉淀，并且不溶于TB缓冲液，这种沉淀是什么呢

迟C迟

有可能是DNA提得好，也有可能是杂质太多~~~有必要的话，可以之后用分光光度计测一下质量。

4 回答83 围观

问如何才能提高质粒提取的浓度？用的omega试剂盒。每次提取浓度就在100ng/ul左右，用于转染根本不够用，一下就用完。

迟C迟

试剂盒已经很不错了,要是提不出浓度很高的质粒,可以试试下面的一些方法：1、增加收菌次数,相对提高了质粒的量,这样的话裂解液的量可以适当增加；2、裂解要充分,变性和复性按说明应该是不超过5分钟,合理控制时间,一般在3分到4分半的时间都是可以的；3、过柱子时,吸附的时间尽量长一些,可以在这期间做做其他实验或者吃个饭什么的；4、如果没有必要,不使用去蛋白液,因为每过一遍柱子,其损耗越大,不过这得根据说明

4 回答684 围观

问文献上用的是NLS(十二烷基肌氨酸钠)提取的，我们实验室没有，所以就用了SDS(十二烷基磺酸钠)提取，但是提到SDS法的论文是同

bamboopiggy

SDS是一种非常高效的表面活性剂，几乎可以使所有的蛋白质溶解。它可以破坏蛋白质的非共价键，从而使蛋白质变性，并丧失天然构象和功能。SDS以质量比1.4:1与蛋白质结合（或一个SDS阴离子结合二个氨基酸分子），因此即使蛋白质样品处于等电点，SDS也能掩饰蛋白质的带电情况，使其带负电。这是被广泛使用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理所在。通常，为了在SDS存在时完全裂解细胞，样品必须经过超声处理或若干次通

3 回答785 围观

问电泳了纯化后的目的片段和载体都有，但载体没目的片段亮，酶连时是不是需要测核酸浓度后再算体积比？

迟C迟

可以通过测定DNA浓度来调整，载体与插入片段比例一般是1:10。

3 回答73 围观

问怎么才能鉴定质粒有没有被双酶切？

迟C迟

跑胶，用未酶切的质粒、单酶切的做参照，条带大小是否符合你的预期。

3 回答123 围观

问小提质粒的产物始终很低，可能是什么原因？

Keven轩

可以试试热洗脱冷结合，最后一步离心除去乙醇之后在60度金属浴上烘干5min让乙醇充分挥发，同时减少洗脱液的量

3 回答145 围观

问在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAC或NaCL至最终浓度达0.1-0.25MOL/L?

bamboopiggy

乙醇沉淀DNA需要盐离子,用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷,降低DNA分子间的斥力,才能沉淀完全.所以需要加NaAC或NaCL

3 回答316 围观

问为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?

bamboopiggy

一、水饱和酚又叫水平衡酚。水饱和酚的PH小于7，一般是PH为5.0左右，通常与异硫氢酸胍一起使用，用于细胞RNA的提取，在酸性环境中，DNA在酚相，RNA在水相。两者就分开了。二、Tris饱和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。其中，酚是强的蛋白变性剂，可以使细胞或组织中的蛋白质变性析出。而Tris的主要作用是防治止酚类氧化，若酚类氧化，则会形成醌（两个苯环），醌含有强自由基，会破坏核酸结构

3 回答613 围观

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