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科研学霸天团，48小时有问必答

问间接法和双抗体夹心法有什么优劣吗？建议使用哪个？

天一湖医者

双抗夹心法：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化，孵育2次，操作简单，减少人为因素的影响，可靠的特异性。间接法：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。缺点：双抗夹心法：缺少链霉亲和素的抗体，起不到型号放大作用，而且抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。间接法：要经过三次孵育，操作步骤繁琐，稍微不注意

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问分光光度测定抗体所使用的抗体的稀释倍数是多少？需要根据补体类型进行调整吗？

bamboopiggy

你用分光光度计测，相当于测蛋白浓度，这个就取决于你测的时候，抗体的浓度和你分光光度计的范围，把抗体稀释到你机器能读的范围内就可以。

2 回答86 围观

问在肉眼或者镜下观察空斑的时候，还是只计数两条边的吗？还是全部都要计数？

bamboopiggy

方框，按照规律，只记数其中相邻的两条边。

2 回答106 围观

问WB实验中条带没有间隔的原因？

bamboopiggy

感觉是你上样浓度太大了，试试降低浓度。还可以降低抗体的浓度。没有间隔。主要是因为发光太强了。

3 回答258 围观

问蛋白质浓度测量不准时，如何保证western blot上样量？

whilt-shirt

先根据BCA结果上一次，再根据第一次实验结果通过校准内参来调节上样量

4 回答106 围观

问western条带杂出来模模糊糊是为什么？

bamboopiggy

你内参不这么模糊吧？你提高一下一抗浓度x,改为1:1000，就好。蛋白上样量太高，你的内参就不好了。

3 回答66 围观

问在Western blot中，经常回收一抗反复使用，但常常遇到即使回收一次的抗体也会发生沉淀，影响最终实验结果，请问如何解决？

bamboopiggy

如果发生沉淀，就不要用了，尤其是非内参抗体。直接新配可能更好。

4 回答96 围观

问EMSA实验，为什么结合的shift有两条带

天一湖医者

结合的shift有两条带，有可能试剂出现问题！

1 回答158 围观

问如何避免荧光定量pcr检测技术的实验误差?

迟C迟

可以从以下几个方面考虑：1、样品的处理及选取处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理。选取实验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织，样品选好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。2、核酸提取加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核酸质量，RNA OD260/280=2.0左右，DNA OD260/280=1.8左右，最好再做电泳检测

3 回答110 围观

问做荧光定量PCR和半定量PCR有什么区别？半定量的PCR退火温度和荧光定量PCR是一样的吗？

迟C迟

荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的，但二者检测的东西多少有些不同。荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料（SYBR green）或者和目的DNA片段结合的荧光探针（taqman)，通过监控PCR过程中的荧光的变化，并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量。荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时

3 回答704 围观

问请问做实时荧光定量PCR实验时，为什么做标准曲线？可以不做标曲吗？实验新手，求指导！

迟C迟

做标曲才可以算出这对引物的扩增效率（其斜率），方便用pfaffl方法来进行相对定量（得到的结果相对精确一点），否则只能默认扩增效率为2，用2^-ddCt(Livak)法来计算，做标曲才可以绝对定量。

3 回答356 围观

问TaqMan荧光探针和SYBR Green荧光探针怎么选择？

迟C迟

TaqMan荧光探针和SYBR Green荧光探针更准确。SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收

3 回答219 围观

问荧光定量pcr TaqMan探针，标准曲线不好，ct值没有按等差数列增加，怎么办？

迟C迟

这个应该是你的模板没稀释准确，或者浓度不合适，如果是数据不成直线，全还是很平滑的曲线，可以勉强用曲线处理。如果不平滑，R方值很小，恐怕结果不太可靠了，只得重做，如果不能重做，只能舍弃不好的数据，用另几个数据得到方程，算出结果，但结果的可靠性就差了，只能对付一下。

3 回答103 围观

问TaqMan荧光PCR检测技术和实时荧光定量PCR技术的区别？

bamboopiggy

taq探针法，除了要设计普通的实时荧光pcr的引物之外,还要设计一条与探针结合的引物。taq探针法精度更高一些，但是普通实验的话，用实时荧光法就好，更方便一些。

3 回答161 围观

问跑出来的胶，杂带太多，怎么回事儿？目的条带都看不清，被杂带覆盖了。

whilt-shirt

可能是抗体浓度过高导致的，建议稀释抗体试试

4 回答191 围观

问C反应蛋白的检测方法为什么有3分钟也有10分钟出结果的，不同点在哪里？

bamboopiggy

这个取决于你用的kit的条件,有的灵敏，可以时间短，温度低，有的不灵敏，就需要时间长一些。有些可能还需要37度孵育。

2 回答501 围观

问WB条带曝光的时候，有一大部分阴影覆盖在条带上，是什么原因

丁香粉猪猪

原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。经验：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议5miundefined5次，不要但是洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了，你又不

4 回答69 围观

问组织TNF-a表达用什么方法看

vae1476

可以用免疫组化，免疫荧光看，比较直观，也可以裂解成细胞，RTPCR或者WB来看

3 回答100 围观

问southern blot 的限制性内切酶怎么选呀，为什么我酶切跑胶，啥也没跑出来？

vae1476

在目的基因上选取一段作为探针。注意探针的特异性，选择一个探针序列内部没有的就可以作酶切位点

3 回答194 围观

问免疫组化量化的过程用imagej总是觉得不准确有什么办法呀？

未来9

重复实验再试试，对比imageJ结果来看

3 回答100 围观

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