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科研学霸天团,48小时有问必答
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WB实验背景不干净,条带也很浅
申东熙老伯
背景不干净一是封闭二是抗体浓度,封闭两个小时没有问题,一抗浓度太高了,可以1:4000或者1:5000稀释。
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WB实验蛋白的另一个条带一直做不出来
c_Yeats
电泳和电转优化方案,胶的浓度,0.22um的PVDF膜,转膜条件(恒流200mA时间优化建议不超过60min)
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药典1207:玻璃酸酶测定法
huarenqiang5
加冷的水解明胶稀释制成每1ml中含1.5单位的溶液。稀释成三份溶液。
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请问在WB电泳的过程中,样品会有逸散,如图所示,请问是什么原因呢
balalaLy
可能是跟buffer中甘油的含量低有关,这种一般影响不大的。
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胶浓度的选择,12%或者15%?
balalaLy
都可以,小分子蛋白肯定是越高浓度的胶越能分得开,如果不需要兼顾其它大分子的蛋白就选15%的
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问
非特异性染色这个困扰问题
小小小小小芳
1抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色,建议用高纯度,高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。单克隆抗体很贵,不过结果真的很好。2一抗浓度太高也是出现非特异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。 3DAB的孵育时间过长,会造成背景非特异性染色。
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内参清晰 目的蛋白白板
汤姆卜丽波
那可能是你的一抗本身有问题,如果你的蛋白已经验证了的话
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求助:Co-IP结果图怎么看,里面的ib、ip是什么意思?
小小小小小芳
IP:immunoprecipitation 免疫沉淀(纯化目的蛋白)IB:immunoblotting 免疫印迹,即Western Blotting(显示目的蛋白)
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做WB杂交检测一个比较大的蛋白的表达量,需要跑很久吗
huarenqiang5
电泳时间:选择分子量最大的预染MARKER,用250kd,然后在电泳槽周围堆满冰,120ma使劲跑吧,跑两个小时换一次电泳液,一直跑到250kd的MARKER,离开胶释放到电泳液中,大概要用5个小时。这时候400kd的蛋白在离开浓缩胶边缘0.5~1cm的地方。
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WB中的蛋白上样缓冲液的选择是DTT还是巯基乙醇的更好些
huarenqiang5
根据个人需求进行选择: 蛋白上样缓冲液(含巯基还原剂)适用于SDS-PAGE(SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)时作蛋白质上样用。其主要成份为SDS,β-巯基乙醇,溴酚蓝缓冲盐溶液等。 蛋白上样缓冲液(含DTT)适用于SDS-PAGE(SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)时作蛋白质上样用。其主要成份为SDS,DTT,溴酚蓝,缓冲盐溶液等。
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请问:我要测TC.TG,现需要取血获得血清,取血时需要在离心管中加入肝素或抗凝剂吗
huarenqiang5
血清的提取不能加抗凝剂,应在取血后尽快中低速离心,全血分层后最上一层澄清液体既是血清。另外需要避免冻融发生溶血,这样血清层也会被染红则无法区分。
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求助!甲醇提取的蛋白用尿素能溶解么
huarenqiang5
能溶。甲醇和尿素都是极性有机分子,并且互相可以形成氢键。
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wb 蛋白散开
balalaLy
连条带以外的地方也是一团黑,应该是你的显影液有问题吧
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原核细菌基因敲入(整合到基因组上)问题
h12356
楼主得到答案了吗?最近遇到了同样的问题 不知道该怎么办
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友友们,求助!!
bamboopiggy
你的kit在保质期吗?你买的蛋白和你用的kit的种属是一样的吗?你有阳参吗?
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问
ELISA检测细胞培养上清离心后的上清需要混匀再加入孔板里检测吗,求解,感谢!!!
balalaLy
最好是先把上清转移到新的管里,混匀后再检测
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问
怎么提取细胞上清做WB?
毛利小五郎的徒弟
先用裂解剂裂解细胞,后离心,取上清。需要加内参,内参相当于对照。
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问
有几个wb的问题想请教一下大家:
balalaLy
膜蛋白以及胞浆蛋白一般就裂解30min差不多了,核蛋白的话就需要时间长一点,可以去到2-3h,中间还需要反复振荡。CST的抗体一般建议用1%BSA或者牛奶配,常规不建议加叠氮化钠,会影响抗原表位,你这个很可能是加了叠氮化钠的原因。
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问
WB都跑完之后,又加了一组实验组怎么办?
juyue2010
需要重新跑,这样各组之间有可比性
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WB条带
毛利小五郎的徒弟
其他条带没问题应该不是抗体降解,考虑还是稀释倍数的问题。
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