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科研学霸天团，48小时有问必答

问原核表达蛋白诱导问题？

申东熙老伯

如果未+IPTG与+IPTG组诱导结果没有差别的话，很有可能蛋白直接没有诱导出来，换个载体重新构建质粒导入新的感受态细胞试着再诱导一下看看，诱导温度和转速还有时间一般不会对诱导结果造成太大差异。

4 回答250 围观

问镍柱层析后收集蛋白溶液怎么保存？

bamboopiggy

pbs透析后，放-80保存就可以。不要反复冻融

3 回答75 围观

问蛋白无活性

bamboopiggy

你是用什么方法判断活性的呢？裂菌后，活性跑到沉淀中去了，感觉是不是形成包涵体了？

3 回答111 围观

问为什么显影时除了目的蛋白，背景中的其他蛋白也有些显影？

balalaLy

一个可能是抗体浓度高，适当降低一抗浓度，另一个可能是抗体用的次数多，重新配一支实在不行就得重新买抗体了

5 回答104 围观

问提蛋白的时候ripa和pmsf 的比例弄错了，弄成了10:1，

inventbiotech

没啥影响，就是有点浪费蛋白酶抑制剂

4 回答286 围观

问想问一下wb对称得条带围着一个中心变浅是因为什么原因呢？

balalaLy

可能是转膜的夹子夹不均匀，导致中间部分比较松，没有把所有蛋白都转到膜上面去

5 回答66 围观

问TLC问题

天一湖医者

最有可能的就是展开板不均匀，薄厚不均一，或者有气泡存在

2 回答53 围观

问实验技术丨求助考马斯亮蓝染胶结果疑问

inventbiotech

蛋白降解不像，降解成弥散装。70kd附近条带跟血清白蛋白很像，如果是组织样本可能是血清污染，如果是细胞样本，可能是培养基血清污染，对样本进行清洗应该可以去除污染。最下方是没有区分开的条带，可以用梯度胶进行分离，效果会好一些

3 回答159 围观

问阻断ELISA

yaonan120

1.是不是阻断剂效果不好呢2.这种情况可以说是灵敏度的问题吧，标记那边是否可以降低标记量。3.降低空白，稀释液中加点BSA可以降低空白。希望可以帮到你

3 回答2319 围观

问WB为什么这么难做，一时有条带，一时没有

inventbiotech

WB其实也是一个很灵敏的蛋白检测技术。蛋白样品提取时产生的偏差会导致条带一时有一时无，尤其时目前大家常用RIPA来进行总蛋白的提取，当目标蛋白处于细胞核，细胞器，细胞膜上，这些蛋白在RIPA提取总蛋白时，细胞核因为裂解的不充分核不破或者是裂解特别大染色质打开样品粘稠核内一些蛋白依然不能释放，细胞器和细胞膜上的蛋白因为是膜蛋白脂质层包裹在RIPA裂解液中溶解度有限，尤其是跨膜蛋白这种问题就更为突出，

4 回答88 围观

问WB曝光后发现无目标条带，但内参条带比较好的原因有哪些

inventbiotech

这种情况可以说明WB操作没问题，需要考虑目标蛋白一抗，目标蛋白如果是外源性表达，需要找一下表达条件，载体。内源性表达，就需要考虑蛋白提取的时候是不是提取出来了，尤其是表达在细胞核细胞器和细胞质膜上的蛋白。提取时如果是用RIPA提取的，很容易将这些部位的蛋白丢失在RIPA的不可溶性组分里。还有一种情况就是这个目标蛋白表达丰度特别低，需要针对于所在部位进行富集再行WB检测

4 回答58 围观

问小鼠肺洗液怎么做Elisa，稀释方法和血清一样么

bamboopiggy

稀释方法是一样的，但是要做个预实验看看需不需要稀释

2 回答154 围观

问求助大家做WB电泳液和电转液重复使用几次

inventbiotech

电泳液内槽每次都是新的，外槽2-3次，电转液重复用不好吧

4 回答173 围观

问做WB的一抗二抗重复利用几次需要换

天一湖医者

做WB的一抗二抗重复利用2次就需要换。

3 回答61 围观

问WB杂His标签的结果，为什么一大团糊糊的

天一湖医者

应该是你转膜的时候，膜和胶之间没有很好的贴合而导致的空泡。转膜时一定要把膜和胶良好贴合才可以，有一个诀窍是在转膜缓冲液中浸泡着贴合，虽然费点缓冲液，但几乎不会出现空泡现象了。如果你用半干转的话，建议你换成湿转法，也可以降低这个问题出现的概率。

3 回答296 围观

问已知蛋白的互作蛋白的筛选

Eason老歌迷

有几种常规方法。我比较习惯用的是免疫共沉淀Co-Ip，是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。传统的Co-IP方法通常是用能够与琼脂糖珠上偶联的protein A特异性结合的抗体免疫沉淀A蛋白质，那么与A蛋白质在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来，以此来验证

2 回答340 围观

问求小鼠肾脏组织NLRP3表达的WB条件

Eason老歌迷

这几个目的蛋白大小的条带，我都跑出来过。我的建议是你转膜时间还是要延长，可能是没转上。然后你跑大蛋白，你的胶可以配10%的跑

4 回答632 围观

问ACE2蛋白做wb

秋秋欣欣

是你的蛋白有问题还是抗体的问题呢，蛋白测浓度检测一下吧

3 回答95 围观

问竞争ELISA和阻断ELISA的区别是什么呢？

天一湖医者

竞争ELISA和阻断ELISA免疫抗体检测方法都可对小反刍兽疫病毒免疫抗体进行检测，在同一块96孔酶标板中，竞争ELISA和阻断ELISA可以分别检测43份、93份和90份样品，但是竞争ELISA的操作相对比较复杂，且用时较多;阻断ELISA的操作简单，用时少。如果同时检测100份样品，竞争ELISA和阻断ELISA的准确率分别为85%、88%和95%，因此阻断ELISA的准确度和重复性均高于其竞

3 回答4787 围观

问这个结果可能是因为哪些步骤出现了何种问题啊？

木笔X3T4

多冲几次一抗，或者延长洗的时间

4 回答71 围观

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