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原核细菌基因敲入(整合到基因组上)问题

相关实验:氨基酸代谢产物分析

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馋3B2C

我在做代谢调控,用的大肠杆菌,因为涉及到过表达的基因太多了,想整合到染色体上面过表达。我先用质粒过表达效果明显,但是一整合到基因组上以后就没有用了。换了启动子,比如T7启动子也没有用,就算加IPTG诱导也不行。想问问大家有成功利用基因整合方法过表达的吗,我不知道是因为敲入压根不行,还是我自己的实验设计和操作哪个环节不对。急!!已经被困了好几个月了!

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4 个回答

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h12356

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楼主得到答案了吗?最近遇到了同样的问题 不知道该怎么办

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汤姆卜丽波

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你整合之后送过测序么,我觉得应该还是在整个过程中发生了突变或者位置不对

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馋3B2Cuser-title

没送过测序。我是质粒上成功过表达了,然后把质粒上启动子到终止子一整条整合上去,前前后后整合了四五个不同的片段,没有一个被整合的基因检测到了过表达~  so  我就觉得是不是整合过表达根本提高不了太多的表达量

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huarenqiang5

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1、插入位点与双链DNA缺口(DSB)的距离是否准确?距离不应该超过100 bp,而最理想的距离是在10 bp以内。

2、瞬转电压是否合适?

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馋3B2Cuser-title

插入位点是一个需要被敲除的基因,切割的位置上下游250左右都被敲掉,然后利用同源重组酶整合的过表达片段  所以应该跟基因断裂位置是没关系的?

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土井挞克树

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还是启动子的问题,可以试着更换启动子,然后加帽加尾,整合几率高一些。

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馋3B2Cuser-title

我想知道大家做整合过表达,表达量能提高多少倍。我做质粒的过表达  相对表达量数值在2000+,整合过表达做qPCR 跟野生型对照无区别,压根计算不了

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