原核细菌基因敲入(整合到基因组上）问题
馋3B2C
我在做代谢调控，用的大肠杆菌，因为涉及到过表达的基因太多了，想整合到染色体上面过表达。我先用质粒过表达效果明显，但是一整合到基因组上以后就没有用了。换了启动子，比如T7启动子也没有用，就算加IPTG诱导也不行。想问问大家有成功利用基因整合方法过表达的吗，我不知道是因为敲入压根不行，还是我自己的实验设计和操作哪个环节不对。急！！已经被困了好几个月了！
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4 个回答
h12356
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楼主得到答案了吗？最近遇到了同样的问题 不知道该怎么办
汤姆卜丽波
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你整合之后送过测序么，我觉得应该还是在整个过程中发生了突变或者位置不对
馋3B2C
没送过测序。我是质粒上成功过表达了，然后把质粒上启动子到终止子一整条整合上去，前前后后整合了四五个不同的片段，没有一个被整合的基因检测到了过表达~ so 我就觉得是不是整合过表达根本提高不了太多的表达量
huarenqiang5
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1、插入位点与双链DNA缺口（DSB）的距离是否准确？距离不应该超过100 bp，而最理想的距离是在10 bp以内。
2、瞬转电压是否合适？
馋3B2C
插入位点是一个需要被敲除的基因，切割的位置上下游250左右都被敲掉，然后利用同源重组酶整合的过表达片段 所以应该跟基因断裂位置是没关系的？
毛利小五郎的徒弟
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还是启动子的问题，可以试着更换启动子，然后加帽加尾，整合几率高一些。
馋3B2C
我想知道大家做整合过表达，表达量能提高多少倍。我做质粒的过表达 相对表达量数值在2000+，整合过表达做qPCR 跟野生型对照无区别，压根计算不了
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