有几个wb的问题想请教一下大家：

膜蛋白以及胞浆蛋白一般就裂解30min差不多了，核蛋白的话就需要时间长一点，可以去到2-3h，中间还需要反复振荡。CST的抗体一般建议用1%BSA或者牛奶配，常规不建议加叠氮化钠，会影响抗原表位，你这个很可能是加了叠氮化钠的原因。

我一般的裂解时间是15min到半个小时，超过半小时没意义。膜蛋白要相应延长。

可能是缓冲液中含有HRP抑制剂 建议避免叠氮化钠和HRP一起使用。

市售的裂解液RIPA有使用说明书，按照上面的步骤是没有问题的，如果担心，可以冰浴时间延长5min，

第二条的现象，如果在体系没有变更的情况下，我是没有遇到过，那可能的原因：叠氮钠没有清洗干净，影响了HRP酶的活性，