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问
补实验的时候,以及想把同一材料的多个基因的表达放一张图,以看出来趋势的时候,如何进行板间校正?
毛利小五郎的徒弟
可以用image做板间校正,把所有结果放在一张图上
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问
如果RNA提取浓度太低(甚至达不到逆转要求的量)的情况下,定量是不是只能靠cDNA浓度?
毛利小五郎的徒弟
如果rna浓度太低,可以靠cdna进行定量,但如果二者浓度差异太大,结果误差也会增高。
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问
同一个样本做同一个基因,做了两个复孔,但是一个孔溶解曲线的温度是81.5,另外一个孔是81度,这是为什么呢?(溶解曲线都是单峰)
毛利小五郎的徒弟
设置的问题,溶解会有不同的温度设置,温度设置差异结果就会有差异,但是相差0.5是可以接受的
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问
qPCR每次做结果都不一样,大多时候各组没有差异,怀疑QPCR不准
毛利小五郎的徒弟
先检查体系是否有降解,每次都不一致的话最可能的就是体系存在降解问题。
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问
加完样本不立即上机,冻-20℃过夜可以吗?
毛利小五郎的徒弟
过夜的话样品很容易降解,建议尽快上机
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问
用质粒做qPCR的时候,低浓度的不同稀释倍数质粒(1undefined4-1undefined1copies/ul)CT值结果很接近,是质粒稀释的问题吗?要
毛利小五郎的徒弟
考虑质粒本身浓度太低,所以稀释后ct值拉不开,很接近。
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问
内参相差1个ct值的结果可以用吗?内参相差多少的结果可以用?如果内参差别比较大样品要如何处理呢?
毛利小五郎的徒弟
差一个ct值是可以用的,如果差的大就需要重新稀释cdna
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问
外周血PBMC提取RNA的技巧(怎么保证提取过程中RNA不被降解)
毛利小五郎的徒弟
减少污染和高温,可以加入稳定剂。
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问
qPCR需要保证每个样本的CDNA浓度一致吗?
毛利小五郎的徒弟
不需要完全一致,保持稀释倍数一致很重要
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问
设置程序的时候体系是10微,实际是20微,对结果影响大吗?
z流沙z
这个问题不大,主要是程序正确就行
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问
有什么能保证3个平行孔扩增曲线一致的加样技巧吗?
z流沙z
配制成预混液,然后分到每个管里面
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问
直接提取并检测dna的话 引物设计有哪些注意的点?和那种mRNA逆转录成cDNA再进行检测所使用的引物以及设计过程是一样的吗?
毛利小五郎的徒弟
直接提取的话引物需要处理,比如把不翻译的修饰部分去掉。
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问
内参不齐会对结果有很大的影响吗?差距多少才算齐?怎么保证内参齐呢
伯乐生命医学产品
内参不齐会对结果有影响,影响大小与差异大小有关。不同样本的内参差距建议在10倍以内,约3.3个Ct值。起始RNA含量一致,完整性相似就可以保证内参基本一致。
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问
求教临床样本组织跑qRT-PCR的一些问题
毛利小五郎的徒弟
可能是pcr过程中目的基因存在降解导致结果不准确
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问
时空组学中使用 nCounter 技术作为 GeoMx DSP 空间分析下游定量技术的项目,分析过程中是否有PCR扩增?
loveliufudan
nCounter技术是一种数字式芯片技术,它使用一系列特异性的探针对RNA分子进行定量测量,而不需要进行PCR扩增。因此,在nCounter技术中,没有PCR扩增的过程。在nCounter技术中,样品中的RNA首先被杂交到数字式探针芯片的探针序列上,然后使用化学发光方法进行检测,以定量测量RNA的存在量。这种技术具有高通量、高精度和可重复性好等特点,被广泛应用于基因表达、突变检测和RNA分子互作等
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问
表面活性剂加入为什么使W/O型微液滴不稳定?
loveliufudan
在微流控制备W/O微液滴时,表面活性剂的作用是降低液滴与连续相的表面张力,从而形成稳定的液液界面。表面活性剂的作用与浓度有一定的关系,但是过高或过低的浓度都可能导致液滴不稳定。当表面活性剂浓度过低时,它不能充分地覆盖液液界面,导致液滴与连续相的表面张力较大,液滴容易破裂。而当表面活性剂浓度过高时,过多的表面活性剂聚集在液滴表面,形成高度曲率的液滴表面,这也会导致液滴不稳定。此外,过高的表面活性剂浓
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问
有大佬可以为右上这个条带出现的问题帮忙进行分析吗
Topmicro
提高退火温度或者重新设计引物序列
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问
rt qpcr试剂盒
Topmicro
温度和时间设定一般不会根据pcr仪不同而改变,根据试剂盒说明书进行设定即可,如果结果不理想再进行优化
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问
请问荧光定量跑的怎么样?
毛利小五郎的徒弟
峰值有重叠,可以更换特异度高一些的抗体
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问
qPCR | Undetermined
z流沙z
部分目的基因表达量低,就没有测出来,这些基因就不适合稀释
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