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科研学霸天团，48小时有问必答
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基因敲除结束后再进行回补，获得的回补菌株没有恢复到原先的水平怎么解释？
Eason老歌迷
要特别注意做回补的时候，移码突变的必须要做cDNA突变，就是同义突变，将CRISPR识别的PAM序列去掉才行，要不然，回补的cDNA也会被切割破坏掉。注意移码突变的过程中，有一定概率出现的WB背景杂带的问题比较麻烦。回补之后的序列可能会干扰到回补片段的表达鉴定。
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问
zea Longa评分法是在拔栓前还是拔栓后
Eason老歌迷
一般是插完2个小时，拔出线栓大概1cm后，就可以评分了。
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问
如何添加CUMS噪声和电刺激？
Eason老歌迷
有专门的实验仪器，每个牌子的设置都不太一样。拿我们实验室的来举例吧，需要电流、电压：0.1A，36V，设定放电刺激T1时间为10秒，间隔T2时间为5秒，自动循环刺激。设置方式如下：按下刺激仪上方红色按钮，手动调整电流,到0.1A，再次按下刺激仪上方红色按钮，手动调整电压到36V。长按设置键，再按动上下键，模式调整到P-6，短按设置键调整T1时间到10，再次短按设置键，调整T2时间到5，再次短按设置
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问
蛋白质和壳聚糖静电结合
Eason老歌迷
它两都发生反应形成复合物了，肯定在280的吸光度下降啊。壳聚糖的游离氨基与蛋白质羧基端的游离羧基在相关酶的催化下脱去一分子水形成肽键，形成以壳聚糖为辅基的蛋白质或壳聚糖-蛋白质复合物。
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问
测维C 一个样就要调配测六个梯度吗？
Eason老歌迷
并不是一定要调配6个，你可以自由的变动，不过主流还是6个为好。目前研究维生素C测定方法的报道较多,有关维生素C的测定方法如荧光法、2，6-二氯靛酚滴定法、2，4-二硝基苯肼法、光度分析法、化学发光法、电化学分析法及色谱法等。
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问
大鼠颈内动脉穿刺模型用的穿刺材料是什么？感觉鱼线不太好用。
Eason老歌迷
我们常用的还是鱼线。鱼线的选择是关键，根据大鼠重量（作的多了后根据动脉粗细就可选择了）选鱼线。我们的经验是250g以下的选0.26mm的线，250-300g的选0.26mm蘸腊的或0.28的都可以。
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问
wb检测，需要多少外泌体，颗粒数？
Eason老歌迷
外泌体是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-200 nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、双层膜结构。如果拿外泌体做wb，需要大概10的8次方个。
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问
α淀粉酶抑制实验结果超过1是为什么？
Eason老歌迷
前两天刚看了一篇文章，阿卡波糖在一定浓度内对淀粉酶抑制作用良好。可以发给你看，做个参考。
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问
葡聚糖包覆的氧化铁能被间充质干细胞摄取吗
Eason老歌迷
葡聚糖包覆的氧化铁能被间充质干细胞摄取。
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问
HIF-1a蛋白WB结果求助
Eason老歌迷
Hif-α的表达受细胞内氧浓度的高度调控，在低氧状态下表达会增多。HIF-1α在常氧下（21%O2）也有表达，只要O2>5%，即很快被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解!
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问
组蛋白ChIP-Seq后，如何设计ChIP-qPCR引物验证某个基因测序结果？
Eason老歌迷
上ucsc网站，可以在搜索框中输入基因名，然后点击go,会出现它的位置，以及对应的富集区域。我们可以看到有富集峰，则可以选择这段的序列设计引物了。如果是有peak信息且富集的程度非常强的话可以设计当成阳性对照，阴性对照找没有peak富集的地方。
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问
双酶切鉴定实验有目的条带，但是底部也出现非特异性条带。
Eason老歌迷
可能是出现了非特异性酶切。是不是你的酶切时间过长，我试过最长切过8小时，有一些内切酶会出现这种情况了。是不是配的酶切体系当中，酶的体积超过了总体积的10%，过量的甘油会影响。
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问
想用流式细胞术测凋亡，应该用双染法么？代理商给我推荐的BD的这种试剂盒。还请问流式细胞术测凋亡应该注意的tips是什么
balalaLy
操作的时候动作要轻柔，染色后尽快检测
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问
如何对分光光度计的数据进行处理？还有一些实验上的细节性问题？有人能搭理一下我吗？
Eason老歌迷
测出标准的已知浓度值溶液对某一波长光的吸收率E，做出吸收率E与溶液浓度N的曲线．然后，对未知浓度溶液在同一波长光下，测出其吸收率，从曲线上就可以求出其浓度值，改变波长，可以重新做出对这一波长的吸收率E与溶液浓度N的曲线，再进行测量。
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问
wb出现2个条带怎么回事？
bamboopiggy
可能是抗体不特异，可能是胶的浓度出现问题，也可能是buffer的问题，或者有的蛋白就是两条带，如果LC3B
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问
转染microRNA minics失败
Miracle星
1.准备不足做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。2.细胞污染细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。首先，转染细胞用的质粒必须保证无菌。而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。分享一个小秘诀：将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了。3.质粒质量
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问
RNA转染时所用培养基需要全新的吗
bamboopiggy
只要你的枪尖是高压灭菌过的，就没有问题。但是要用无血清的。
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问
氧化铁纳米颗粒虽然粒径很小，但很难过0.22um的滤膜，大家有什么解决方案吗？
Eason老歌迷
虽然可能是粒径很小，但是考虑有没有吸附的作用?
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问
组织片TUNEL染色后凋亡率计算
Eason老歌迷
可以用iamgeJ来计算。也可以人工来算，首先是选取5个高倍视野，找500个细胞来数凋亡数，然后比值。
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问
RNA稳定放线菌素D实验，结果曲线在某一时间点忽然翘起的原因？
Eason老歌迷
放线菌素D抑制RNA合成，是不是在这个时间点实验条件抑制了它的作用
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