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丁香通

转染microRNA minics失败

相关实验:细胞转染

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dxy_lgbve3zq

刚转染的时候细胞是有淡淡的荧光的,但是等换液的时候再观察就没有了,没有转进去,不知道是什么原因。转染条件都试过了,转染试剂也换过了,minics也重新合成了,到底是什么原因呀

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4 个回答

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Miracle星

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1.准备不足

做细胞转染的时候,在开展正式实验前要多做预试验,优化转染条件。优化转染条件包括:转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。

2.细胞污染

细胞污染也是造成细胞死亡,转染效率低下的一大原因。首先,转染细胞用的质粒必须保证无菌。而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。分享一个小秘诀:将提完质粒后或者提的最后一步,用75%乙醇沉淀,这样就除菌了。

3.质粒质量问题

转染用的质粒首先要保证数量,一般为2μg以上。质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质,也会影响转染效率。这个时候,就应该对质粒进行纯化和浓缩。

4.细胞状态不好

细胞状态不好,会导致转染效率低下。一般进行转染的细胞应该处于对数生长期。如果是贴壁细胞的话,贴壁率应该在70-80%;如果是悬浮细胞的话,应该是6×105个/孔(24孔板),一般是转染前一天换液,转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。

5.转染试剂问题

脂质体试剂毒性较大,易造成细胞死亡和转染效率底下。可选择非脂质体转染试剂,如Entranster试剂。

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Eason老歌迷

有帮助

细胞污染也是造成转染效率低下的一大原因。首先,转染细胞用的质粒必须保证无菌。而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。分享一个小秘诀:将提完质粒后或者提的最后一步,用75%乙醇沉淀,这样就除菌了。

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bamboopiggy

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按照你用的转染试剂的protocol进行操作,可能你那一步少了

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天一湖医者

有帮助

最好先用一个荧光标记的阴性对照做一个转染条件的摸索。

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