放射性标记 DNA 探针的制备 l 聚丙烯酰胺凝胶的制备 1． 按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将 10 × TBE 稀释成 0.5 ×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测 DNA 片段的大小， 200bp 左右的片段需要 4 ～ 5 ％的凝胶，小于 100bp 的片段应灌制 6 ～ 8 ％的凝胶。 l DNA 的标记 1． 用两种限制性内切酶从 10 μ g 质粒上将待测 DNA 片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生 5’ 凸出末端。酶切体系终体积 50 μ l ，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应 1 小时。 2． 向酶切反应混合液中加入 [ α－ 32 P]dATP （约 10 μ Ci/ μ l ） ( 若 5’ 凸末端含 T 残基 ) 10 μ l dCTP(2mmol/L)

磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定 l 磷酸化作用化学计量的确定 1． 在冰上建立下列反应混合液： Tris-HCl （ 50mmol/L ； pH8.0 ） /MgCl2 （ 10mmol/L ） 250 μ l ATP （ 10mmol/L ） 1 μ l 纯化的 DNA 结合蛋白（ 1mg/ml ） 4 μ l [ γ -32 P]ATP （ 13 μ Ci ） 1.3 μ l 2． 将反应液混合物分成 125 μ l 的两个部分，记为 A 部分和 B 部分。 B 部分将被用于动力学实验。 3． 在 6 个干净管中各加入 20 μ l A 部分溶液，然后各管中依次加入 0 ， 0.5 ， 1 ， 2 ， 3

聚合酶链式反应体外扩增 DNA 1. 按以下次序，将各成分加在 0.5 ml 灭菌离心管、扩增管或灭菌滴定板的孔内混合： 10 ×扩增缓冲液 5 μ l 20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液（ pH 8.0 ） 1 μ l 20 μ mol/L 正向引物 2.5 μ l 20 μ mol/L 反向引物 2.5 μ l 1 ～ 5 U/ μ l 热稳定 DNA 聚合酶 1 ～ 2 单位 H2 O 28 ～ 33 μ l 模板 DNA 5 ～ 10 μ l 总体积

PCR 的优化 在 PCR 的优化开始阶段，应用新的 DNA 模板，引物或热稳定 DNA 聚合酶等材料建立的 PCR 方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种 PCR 反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的 DNA 产物的产率。表 1 列举了一些通常遇到的问题和对 PCR 反应进行优化的一些推荐方法。 表 1 PCR 扩增的疑难解析 问题 解释 补救措施 目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈不清晰的成片条带，条带在凝胶中扩散到较期望分子量更小的 DNA 分子量的区域内。 无效引导或无效延伸 通过建立两个引物不同浓度的 P

四） 测效价和制备文库平板 1． 取 500ml 消毒培养瓶，注入 100ml 消毒 LB 培养液，再接种入 2ml 含有新鲜 LE392 细菌的麦芽糖液，培养至 OD600 近 1.0 。 2． 收集细胞分别于两个带螺旋帽 50ml 聚苯乙烯管中； 2500g 离心 10 分钟。 3． 弃上清，把每一沉淀物重悬入 25ml 消毒的 10mM MgSO4 中。 4． LE392 细胞在 4 ℃中可存两周；贮存过长会降低接种存活率。 5． 接种噬菌体和测效价：从每 250 μ l 包装反应液中取 1 μ l （从前（三）中 5 ），加入到 99 μ l TMG 中，分 1 μ l 和 10 μ l 此稀释液加入 13mm （直径）× 100mm （长）消毒管中；同时也稀释和铺制克隆载体平板、连接和包装，但无插入（三种 A 管），作为本底对照。 6． 从 4 步骤向每管中加 200 μ l LE392 细菌，混匀，室温孵育 20 分钟。 7． 加 2.5ml 含有 10 mM MgSO4 的上层琼脂（ 48 ℃）；在室温中把每管立即倒入琼脂平板

在质粒载体中进行平末端片段的克隆 1． 分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化 1~10 μ g 质粒 DNA 和外源 DNA 片段，使它们能产生平末端。 2． 苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源 DNA 片段。 3． 分别用 TE （ pH 8.0 ）重新溶解纯化出的两种 DNA 沉淀，使终浓度为 100 ng/ml 。 假设 1 bp 相当于 660 Da ，计算 DNA 的终浓度（ pmol/ml ）。 4． 将载体 DNA 去磷酸化。 5． 按下表将适量的 DNA 转移至无菌的 0.5 ml 离心管： 管号 DNA A 和 E 载体 1 [60fmol (~100ng)] B 外源插入片段 2 [60fmol (~10ng)]

原核细胞 l 用 IPTG 诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建 1. PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段，片段 5’ 端和 3’ 端带有与 IPTG 诱导表达载体对应的限制酶位点。 2. 含靶 cDNA/ 基因的 DNA 片段与表达载体连接。 3. 重组质粒转化有 lacI q 等位基因的大肠杆菌菌株。如果质粒本身有 lacI 基因，可以使用任何适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄（ 50 μ g/ml ）的 LB 平板，于 37 ℃过夜培养。 4. 通过菌落杂交和 / 或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体。 诱导靶蛋白表达的优化 许多研究表明细胞生长速率严重影

调节瞬时转染基因的表达 l 四环素作为哺乳动物细胞中可诱导基因表达的调控物 阶段一： pTet-tTAk 稳定转染成纤维细胞 培养和转染细胞 1. 在 DMEM 完全培养液中培养贴壁细胞。转染前一天，把细胞换到含有 0.5 μ g/ml 四环素 -HCl （四环素）的 DMEM 完全培养液中。每个 10 cm 培养皿中加入足量细胞，使转染那天，细胞可以有 33% 的汇合度。 2. 在合适的限制性内切酶位点使质粒线性化，并把每秒质粒的浓度调整为≥ 0.5 mg/ml 。 10 ～ 20 μ g 质粒 pTet-tTAk 和 1 ～ 2 μ g pSV2-His （ Tet 质粒与带选择标记的质粒的摩尔比大约为 10 ： 1 ）与 500 μ l HEPES 缓冲液在一个干净的 4 ml 聚丙乙烯管中混合。 3. DNA 混合物中加入 32.5 μ l 2 mol/L CaCl2 。立即轻轻振荡使溶液混匀。溶液在室温保存，不时地混匀。 15 ～ 30 mi

差减 cDNA 文库法 [ 第一条链 cDNA 合成 ] 1． 合成第一条 cDNA 链时，所有试剂应按下列顺序依次加入： 10 ×第一条链合成缓冲液 5.0 μ l 10mM dNTP Mix(1.4 μ g/ μ l) 2.5 μ l( 终浓度 1.25mM) Linker primer(1.4 μ l ，终浓度 100 μ g/ μ l) DEPc H2 O RNase block Ⅱ (1U/ μ l) 1.0 mRNA 1~5 μ g 混合，离心 20 秒钟，室温放置 10 分钟 2． 加入逆转录酶至 1500U/ml ，补水到终体积 50 μ l 。 3． 混合，取出 5 μ l 放入含有 0.5 μ g α -32 P dATP （ 800Ci/mM ），分别保温在 37 ℃ 1 小时。 4． 保温后，带有同位素的离心管放入

差异显示法 [ 原理 ] ： 该实验方法是针对从特定细胞或组织类型的 mRNA 池来源的样品用 PCR 技术对其中许多的 cDNA 基因一起进行扩增和显示的实验方法。该实验方法倚赖两套不同类型的合成寡核苷酸引物：一套锚定反义引物与一套随机正义引物。锚定反义引物是与 mRNA 的 poly(A) 尾及 3’- 非翻译区的连接处相复性结合。正义引物是一种 10-mer 的随机引物，将锚定引物与随机引物加入反应混合液，用 PCR 技术进行双链 cDNA 产物的扩增。通过比较两种不同细胞类型或在不同生长条件下同种细胞类型来源的扩增 cDNA 产物的电泳带谱，能够用于鉴定其表达基因图谱的差异。 方法： [ 优化 DNA 浓度： cDNA 第一链的制备 ] 1． 用几支 0.5 ml 离心管，设立实验反应管系列，建立对照管和实验管的 RNA 最佳浓度。用水对 RNA 样品进行 5 倍连续稀释系列，产生 RNA 样品浓度范围在 1 μ l/ml 与 100 μ g/ml 之间系列。 2． 从锚定 3’- 寡核苷

胚胎中细胞基因打靶方法 置换型设计物的制备 1． 选择靶基因的一个部分作为设计物的组成，还包括有靶基因的另一个部分作为 Southern 杂交探针，以鉴定细胞中是否已发生同源重组之用。 2． 在质粒载体中构建一个克隆； neo 基因能阻断靶基因的表达，在 neo 的两侧保持保留同源区；在同源区外的置换型设计物中包含一个胸腺嘧啶激酶（ TK ）基因。 3． 用限制性内切酶消化设计物 DNA 使成线形；设计物 DNA 线形化后，质粒 DNA 仍附于在 TK 基因上。如果设计物在基因组发生随机插入中出现任何 DNA 序列丢失时，线性态有助于保持 TK 基因的活性。 4． 用酚 / 氯仿抽提设计物 DNA 。 5． 用加两个体积的 95 ％乙醇沉淀，微型离心机离心 30 秒，去上清，使沉淀物干燥到仍保持微湿润状态。 6． 把沉淀物溶于 100 μ l 水中，检测是否已被彻底消化，在凝胶电泳中测定 DNA 的浓度。 转染设计物和 ES 细胞的选择 7． 把细胞培养在 E

纯合克隆筛选 1． 融化杂合突变 ES 细胞， ES/LIF 培养液培养，每 2 ～ 3 天传代，实验开始把细胞接种到三个 100mm 铺有凝胶碟皿中，每皿接种 1 ～ 2 × 106 细胞。为筛选需用一个以上的 ES 杂合突变细胞系，因不同细胞系的转化效率不全相同，另外对检测细胞表型也需如此。 2． 每皿细胞分别加入 1.0 ～ 2.0mg/ml 的 G4178 （终浓度， pH7.4 ）；应用 neo 和 hyg 基因作为筛选标记效果都很好，用 hyg 时浓度为 1.0 ～ 2.0mg/ml 的 hygromycin- β的 ES/LIF 培养液。 3． 培养细胞 7 ～ 10 天，每天换液，仍用含有适当浓度 G418 的 ES/LIF 培养液，培养至出现很多单个克隆为止；如细胞已长满而未出现单个克隆时，应重复 2 ，并加大 G418 浓度。 4． 按前述杂合突变所述 15 ～ 21 步筛选法进行克隆筛选；在出现有杂交片段表示在纯合突变细胞中不存在无改变的靶基因。典型情况下，应有 50 ％为纯合的，这是因为此过程是随

RFLP 法 1 ）常规制备 DNA 盐析法 1． 用淋巴细胞分离液从抗凝血中分离出白细胞。 2． 每 3ml 细胞悬液加 10ml 红细胞裂解液溶解红细胞两次，再加 2ml 白细胞裂解液溶解白细胞。 3． 加 50 μ l 10 ％ SDS 和 70 μ l 蛋白酶 K 消化蛋白质， 37 ℃过夜或 55 ℃ 3h 。 4． 加 0.25 体积饱和醋酸钠溶液，剧烈摇动 15s 。 5． 2000r/min 离心 15min ，收集上清。 6． 加入 2.5 倍预冷无水乙醇沉淀 DNA ，－ 20 ℃过夜。 7． 吸取 DNA 团块用 70 ％乙醇洗 3 次，每次 10 000r/min ， 10min 。再溶于适量 TE 缓冲液中， 4 ℃保存。 酚抽提法 1． 采集 EDTA 抗凝血 0.5ml ，加双蒸水 2.5ml ，溶解红细胞。 2． 离心 10 000r/min ， 5min

PCR － RFLP 法 1 ）提取细胞总 DNA 方法同前。 2 ） PCR 扩增引物的设计 1． 引物长度一般为 15 ～ 30bp ， G ＋ C 含量应在 45 ％～ 55 ％之间。 2． 应避免连续出现 4 个以上的单一碱基。 3． 不能含有自身互补序列。 4． 两个引物之间不应有多于 4 个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体。 5． 与非特异扩增序列的同源性应小于 70 ％，或少于连续 8 个互补碱基。 6． 扩增 HLA-D 区基因多态性区段的引物应在该区第二外显子或高变区的边缘。 3 ） PCR 扩增 1． 每 100 μ l 反应体系中分别加入：缓冲液 10 μ l ，引物各 25pmol ， DNA 1 ～ 2 μ g ， 10 μ l dNTPs ，混合均匀后在 95 ～ 97 ℃变性 5 ～ 10min 。 2． 加 Taq DN

PCR － SSO （ ASO ）探针法 1 ）常规提取 DNA 参见 RFLP 法 2 ） PCR 扩增 参见 PCR-RFLP 法 3 ）斑点杂交 1． 将 5 ～ 20 μ l 扩增产物，加变性液 100 ～ 200 μ l 室温处理 5 ～ 15min 。 2． 在尼龙滤膜（预先用 2 × SSC 浸湿 2min ）上真空点样，每孔以 10 × SSPE 200 μ l 冲洗，抽干， 80 ℃干燥 2h 。 3． 标记探针，取标记缓冲液 2.5 μ l ，寡核苷酸片段（ dCTP, dGTP, dTTP ） 50 ～ 100ng ， [ γ -32 P]ATP 2.5 μ l ， T4 多核苷酸酶 10U ，双蒸水加至 25 μ l ，混匀， 37 ℃保温 45min ，用 0.5mol/L EDTA 1 μ l 终止反应，标记的探针可直接使用或采用柱层析分离标记好的探针。

几十年来生物学上最重要的进展，也许是关于RNA分子能调节基因表达的发现。RNA干涉（RNAi）是指双链RNA分子使基因表达沉寂的现象，是在线虫中发现的，在 1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。 此后，科学家们明白，RNAi还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强大工具，又是很多生物的基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。RNAi肯定有很多新用途，RNAi还可能具有一些仍然有待去发现的天然功能。 RNAi实验原理与方法 近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。 一、RNAi的分子机制 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被

　　自1987年秋以来，PCR技术的应用开创性地推动了产前单基因缺陷者及携带者的 诊断。目前PCR还不能用于诊断所有已知缺陷疾病，但极大地扩大了实验诊断学家对 诊断方法的选择。JohnHopkins大学的研究人员表明，在诊断基因缺陷疾病方面PCR技 术具有快速、准确、操作灵活等特点。每项进展的实例在以后描述。在1987年10月 前，我们用Southern印迹法产前诊断镰刀红细胞贫血症通常需要两周或更长时间，而 1987年10月以后，应用PCR只需2-4天。在1987年以前，几乎所有的β－地中海贫血症 的产前诊断都是通过检测在β－珠蛋白簇中连锁DNA的多态间接完成的，一般需要2-4 周。1987年10月以后，用PCR扩增β－珠蛋白基因区后，直接检测致病突变即可完成 β－地中海贫血症的产前诊断。这个方法既增加了准确性，又缩短了时间，一般只需 一周时间。该项改进技术的作用，（1）如果我们不能确定在父母双方中β－地中海 贫血的突变位置，我们还可以在1、2天之内研究β－珠蛋白基因簇中DNA的多态性； （2）通过比较母亲与胎儿DNA序列差别来判断母亲传染的程度。这只是说

　　骨肿瘤较罕见，恶性骨肿瘤只占全身恶性肿瘤的1%，男多于女，性别比约为1.6 ∶1，均好发于10-30岁间，良性者以骨软骨瘤最多，依次为骨巨细胞瘤、内生软骨瘤 等，恶性者以骨肉瘤最多，依次为软骨肉瘤、纤维肉瘤等.骨恶性肿瘤的发生机理目 前认为是癌基因显性作用与抗癌基因失活的结果，是多种癌基因多阶段多途径协同作 用的结果.骨恶性肿瘤转移涉及到肿瘤细胞自身与宿主细胞之间错综复杂的关系，受 多种相关基因的调控，即肿瘤的转移与转移基因和转移抑制基因有关，与生长因子及 其受体的表达以及某些癌基因产物有关.因此，通过对活化的癌基因及抗癌基因改变 的检测，可以快速分析患者肿瘤的易感性及判断肿瘤的预后;检测耐药基因的表达程 度，可为肿瘤的诊治提供方案选择的依据;通过对转移基因及转移抑制基因的检测， 可以判断肿瘤有无转移，对手术治疗案提供依据. 　　PCR技术是一门新型快速诊断技术，具有敏感、特异、专一性强等特点，在骨肿 瘤诊断及研究方面具有其它方法难以比拟的优越性. 一、PCR技术在骨肿瘤诊断中的应用 　　骨肿瘤诊断需要解剖学、组织学和胚胎学等基础知识，对病变需认真观

　　基因突变(gene mutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶 性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究 的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要 ＼意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术的出现及近年来以PCR技术为基础， 结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、准确的基因分析途 径，并取得了令人瞩目的成果. 　　基因突变是癌基因激活，抗癌基因失活及遗传病发生的根本原因，从广义的角度 来看，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变三种形式，只是它仍所涉及的 范围不同，后两种基因突变涉及的基因较多，可通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中 期的染色体而检出.亦可在间期用标记探针检出，点突变通常的涉及的范围较少，它 是肿癌和遗传病发生的主要分子改变，因此，它是基因分析的主要研究内容.不同类 型的基因突变有不同的检测途径，大致方法包括：应用基因探针直接检测；应用PCR 技术检测；利用探针技术进行分析。 PCR在突变基因检测时的应用 　　

　　自从1985年PCR技术首次应用于遗传病基因诊断以来，已有近百种遗传病可用PCR 技术进行诊断和产前诊断，利用PCR技术诊断遗传病的途径有五个，①基因突变位点 的直接检出②筛查与遗传病③④有关的点突变③遗传多态性标记连锁分析间接诊断④ 利用cmRNA逆转录为cDNA进行分析或直接分析cmRNA. 　　传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术为基础而建立的一些检测方法，包括 Southerninnouthern印迹杂交，RFLP为，它们可直接分析基因的缺失和重排，亦可利 用RFLP时行连锁分析，但由于这些技术操作繁琐，探针来源困难所需设剂昂贵，且要 用同抗素.完成一项诊断需要的时间亦较长，因此难于满足临床诊断的要求.限制了它 在临床上的应用.PCR技术是一种在体外的海促DNA合成技术，它能在短时间内将靶DNA 扩增百万倍，而且操用简便，省时，准确性也高，它不仅能直检突变基因，而且可与 其它技术结合，使其诊断的准确性几达100%.而且不同同位素操作.能最大限度的满足 临床诊断的需要.因而它已成为目前遗传病诊断的产前诊断的主要手段. 一、PCR技术诊断遗传病的基