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3 年免疫共沉淀经验总结

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。它可以:测定两种目标蛋白质是否在体内结合;确定一种特定蛋白质的新的作用搭档;分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。 实验原理当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X,那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前多用精制的 ...

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4.18 丁香实验科研资讯早报(每日更新)

① Nature挑战长期观点:死去了还可以恢复大脑功能;② Nature发布“癌中之王”重要研究成果——发现关键蛋白;③Nature子刊:多个平台全面鉴定结构变异;④单基因突变与人类肥胖有关

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两大方法帮你搞定质粒构建

质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。原理依赖于限制性核酸内切酶,DNA 连接酶和其他修饰酶的作用,分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。质粒构建方式多样,常规的 T4 连接酶,以及最近更受欢迎的重组酶方式。下面小编就总结一下 T4 连接酶与重组酶构建质粒方法,通过比较,其最大的不同点可能在于目的基因的设计以及连接体系。 壹 一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶, ...

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6 大步骤帮你搞定免疫荧光化学

免疫组化是门很复杂的学问,同时也是一场浩大的工程。在常规的生化实验当中,说它是最复杂的小实验也不为过,真正诠释了细节决定成败。当然,免疫组化的概念其实很大,本文所提及的只是免疫组化中的免疫荧光化学。 1 冰冻切片 or 石蜡切片免疫组织荧光,一定首选冰冻切片而非石蜡切片。两者的区别主要在于冰冻切片能较完整地保存抗原免疫活性,但组织结构会受到冰晶等的影响而变形,石蜡切片则相反。虽然石蜡切片可以做抗原修复,但是,它不是麻烦嘛!所以想 ...

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PCR 引物不用愁,一个网站全搞定

还在为设计 PCR or qPCR 引物耗损脑细胞吗?还在为 P 不出条带而不断摸索条件费时费力吗?还在为 P 出了条带,but,有 N 条条带而纠结痛苦吗?下面,笔者将介绍一个神奇的网站,只有输入你想研究的基因名,就能找到合适的引物。PrimerBankPrimerBank 是一个 PCR 引物的公共数据库。 其引物可以用于 PCR 或 qPCR,共包含超过 306 800 个引物,涵盖大多数已知的人和小鼠基因。有几种方法可以搜索 PrimerBank 上的引物:GenBank 登录号,NCBI 蛋白质 ...

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LncRNA 亚细胞定位,这个网站就够了

「亚细胞定位」已是高水平期刊对 lncRNA 研究的基本要求。一提到 lncRNA 定位,马上想到 FISH 的小伙伴肯定是学霸。今天推荐一个检索 LncRNA 亚细胞定位信息的专门网站。不卖关子,直接上链接,lncATLAS:http://lncatlas.crg.eu/。目前该网站已收集了经 GENCODE 注释的 6 700 余种 lncRNA,涵盖在人体 15 种细胞系中的定位信息。网站搜索很简单,刚一接触这个网站时,发现返回的图形化结果不好懂。我就 email 网站开发者,表达 ...

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做好细胞划痕,只需这 6 步

细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法,实验成本低,可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。 1 实验步骤实验材料:细胞样品实验仪器与耗材:6 孔板、marker 笔、直尺、枪头实验试剂:无血清培养基、PBS 2 实验操作准备:所有能灭菌的器械都要灭菌,直尺和 marker 笔在操作前紫外照射 30 min(超净台内)。先用 marker 笔在 6 孔板背后,用直尺比着,均匀得划横线,大约每隔 0.5~1 cm 一道,横穿过孔。每孔至少穿过 5 条线。在空中加入约 5X105 个细胞,具体数 ...

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4.17 丁香实验科研资讯早报(每日更新)

①Cell杂志最受关注的五篇文章(4月);②解开中枢神经系统自身免疫性炎症谜团 Nature子刊发现关键的表观遗传机制;③对于不明原因的肝病,外显子组测序显神威;④PNAS发现一种阻止肿瘤细胞免疫逃避的新生物标志物

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献给初学者:酶联免疫吸附实验

酶联免疫吸附(ELISA)可以:免疫酶染色各种细胞内成份的定位研究抗酶抗体的合成显现微量的免疫沉淀反应定量检测体液中抗原或抗体成份 01实验方法原理双抗体夹心法(常用于测定抗原)双抗体夹心法测抗原示意图用特异性抗体包被于固相载体,经洗涤后加入含有抗原之待测样品,如待检样品中有相应抗原存在,即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合,经保温孵育洗涤后,即可加入酶标记特异性抗体,再经孵育洗涤后,加底物显色进行测定,底物降 ...

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献给初学者:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

所谓实时荧光定量 PCR 技术,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 样品 RNA 的抽提步骤取冻存已裂解的细胞,室温放置 5 分钟使其完全溶解。两相分离 每 1 ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2 ml 的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15 秒后,15 到 30 ℃ 孵育 2 到 3 分钟。4 ℃ 下 12 000 rpm 离心 15 分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大 ...

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轻松学会寻找 crisprcas9 目的基因 CDS 序列

最近 CRISPR/Cas9 基因敲除技术可谓风靡全世界的实验室,CRISPR 被称为规律成簇间隔短回文重复,其实际上就是一种基因编辑器,是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统。后来,研究人员发现,它似乎是一种精确的万能基因武器,可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因。由于其相对于前几代基因敲除技术而言更为简便高效。所以一经问世便受到科研界的热捧。利用 Cas9 质粒建立 knock-out 细胞系实验过程主要有以下几步:1. 确定待 ...

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芯片表达简单差异分析

最近实验室的小师妹要开题了……师妹:课题还没有,预实验也没做,文献也没看,以前只顾玩了,肿么办?救命啊,师兄…… 呜呜……师兄:我能怎么办?怪我咯,不听师兄言,吃亏何止一点点(我默默地在心底得瑟了 3 秒,为什么是 3 秒呢?)。师兄:我的师妹啊,亲师妹啊!老板说的,你就跟着师兄吧。所以,师兄的内心是只可意会,不可言传……师兄:有没有感兴趣的方向?或者老板怎么说?师妹:呜呜…… 没有。老板说让我从头先做芯片表达差异分析。师兄有没有什么简单速成的可以应付开题?师 ...

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手把手教你用 Fast Tree 快速构建序列进化树

常见的建树方法有:贝叶斯法(Bayesian),最大似然法(Maximum likelihood,ML),最大简约法(Maximum parsimony,MP),邻接法(Neighbor-Joining,NJ),最小进化法(Minimum Evolution,ME),类平均法(UPGMA)。一般来讲,如果模型合适,最大似然法的效果较好。对于近缘序列,最大简约法用的假设最少,各种方法结果相似。而对于远缘序列,一般使用最大似然法或邻接法。对相似 ...

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手把手教你用 dyyTrizol 法提取 RNA

手把手教你用 dyyTrizol 法提取 RNAYolander 生物学霸 2018-01-021准备1. 电泳:RNA 专用 0.5×TBE 缓冲液、DEPC 水2. 超净工作台:无 RNA 酶污染的枪头及 EP 管(1.5、0.2 ml)、镊子、1.5 ml EP 管架、离心管架、0.2 ml PCR 管架(200 μL 枪头盒代替)污物缸。一次性薄膜手套和橡胶手套、卫生纸、75% 乙醇、RNase Free 水、15 ml 离心管。2样品处理:RNA 提取前的步骤☞ 悬浮细胞每 1 ml Trizol 可裂解 5×106 动物、植物或酵母细胞,或 107 细胞。☞ 贴壁细胞1. 从培养箱 ...

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湿兄,检测磷酸化蛋白要加磷酸酶抑制剂吗?

最近很多人问毛老师关于磷酸化的问题。比如:要检测的蛋白有磷酸化的,要加磷酸酶抑制剂吗?在做 erk1/2 磷酸化表达实验,提取总蛋白的时候需要加入磷酸酶抑制剂,什么抑制剂比较好?答案是:当然必须一定要加啊!毛老师来给大家简单解释一下。许多生物学过程和通路的调节都伴随着磷酸酯的形成和去除。而蛋白的磷酸化状态的平衡是由蛋白激酶和磷酸酶相互影响达到的。其中一个重要的步骤就是准确的观察一般和特异的磷酸化状态。在细胞裂解的过程中 ...

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国自然最新热点外泌体,你 get 到了吗?

1、 外泌体已成为生命科学/基础医学研究一大热点2018 年国自然基金评审结果已尘埃落定,其中医学科学部共计有 9830 项获得了基金委资助。从数据来看,热门的几个方向依然火热:外泌体、非编码 RNA、表观遗传、肠道菌群、m6A、CRISPR/Cas9 技术等,其中,涉及到外泌体的研究项目 401 项,总资助经费 1.7 亿元。哈尔滨医科大学李悦教授「外泌体 miRNAs 介导细胞间应答网络调控心房代谢重构在心房颤动中的作用与机制」获得了重点项目资助。外泌体中标项 ...

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基因组编辑技术应用于作物遗传改良的基本原则及进展(下篇)

1. 基因组编辑技术应用于作物改良的基本原则1.1 ZFNs、TALENs 和 CRISPR/Cas 如何抉择ZFNs、TALENs 和 CRISPR/Cas 都是有效的基因组编辑技术,但三者在设计、特异性和效率上各有不同。ZFNs 由于特异性不高、脱靶问题严重及获得 ZFN 蛋白非常困难,严重阻碍了其广泛应用。TALENs 的优点是特异高、脱靶效应低,但载体构建较繁琐、编辑效率不是很高、且难以同时对多个基因进行编辑。CRISPR/Cas 系统的优点是编辑效率非常高 ...

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基因组编辑技术应用于作物遗传改良的进展(上篇)

基因组编辑技术是指可以在基因组水平上对 DNA 序列进行定点改造的遗传操作技术,其在基因功能研究和改造、生物医学和植物遗传改良等方面都具有重大的应用价值。科学家自 20 世纪 90 年代末就开始探索基因组定点编辑技术,但直到 2002 年,也仅在小鼠和果蝇等少数模式生物中实现了同源重组介导的基因组定点编辑,且因同源重组的效率很低,限制了其应用前景。进入 21 世纪后,随着蛋白质结构与功能研究的新突破和人工核酸内切酶 (engineeredendon ...

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重组蛋白制备工艺优化策略

重组蛋白纯化基本原则蛋白的分离纯化是生物工程下游阶段一个比较重要的部分,尤其在基因工程重组蛋白的分离纯化中,上游过程的许多因素会直接影响到下游蛋白的分离,充分利用上游对下游的影响,对蛋白的纯化做一个全面的考虑和整体的设计。是否带有亲和标签,His标签,GST标签等,不同的亲和标签选择不同的纯化方案;可能是可溶性表达,可能形成包涵体,可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤,而包涵体易于分离,纯度较高,但回收具有生物活 ...

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小鼠药物干预后两种蛋白的磷酸化酪氨酸水平检测

小鼠XX细胞药物干预后两种蛋白的磷酸化酪氨酸水平检测 实验分组:小鼠XX细胞,按下面分组进行药物干预培养,并收集细胞进行免疫沉淀实验。 1正常对照组2高糖组3高糖+E药物4高糖+A药物(25μM)5高糖+A药物(50μM)6高糖+A药物(100μM)7高糖+A药物(100μM)+B药物(1mM)8高糖+C药物(25μM)9高糖+C药物(50μM)10高糖+C药物(100μM)11高糖+C药物(100μM)+B药物(1mM)12高糖+D药物( ...

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