MTT（四唑盐）比色法

MTT 法是 Mosmann 1983 年报道的，以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的 formazan 量成正比。再用酶标仪测定 OD 值。

实验原理

MTT 法是 Mosmann 1983 年报道的，以后此方法得到了迅速发展并广泛应用于临床与科研研究。其原理是活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的 formazan 量成正比。再用酶标仪测定 OD 值。

实验步骤

一、实验前应明确的问题

1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有 10⁵ 个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行 MTT 试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。

2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。

3. 时间点的设定。在不同时间点的测定 OD 值，输入 excel 表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

此处内容较多，有部分实验步骤省略，想查看更多详情，请点击「阅读原文」查看。

二、贴壁细胞

1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100 ul，铺板使待测细胞调密度至 1 000～10 000 孔，（边缘孔用无菌 PBS 填充）。

2. 5% CO2，37℃ 孵育，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般 5～7 个梯度，每孔 100 ul，设 3～5 个复孔。建议设 5 个，否则难以反应真实情况。

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三、悬浮细胞

四、MTT 的配制

五、细胞的接种（铺板）

实验心得分享

1. 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的 3～4 倍，可能比较容易混匀。10 ml 的离心管里面最好装 3～4 ml 的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。

2. 吸管的吸液量最好在 1 ml 左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量 1 ml 多的吸管，总液量在 5 ml 左右为益。

3. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。

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