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🔥 细胞粘附实验(MTT 比色法计数)

相关实验:细胞粘附实验

别名:MTT 法

最新修订时间:

丁香实验推荐阅读

合作专家 | 郭新容硕士

临床医学 中南大学

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审核专家 | 聂壹峰博士

纳米生物医学 中国科学院大学

简介

体内细胞想要运动要先脱离其他细胞,从而使细胞粘附能力发生改变,细胞粘附实验主要用于判定细胞在经过各种药物处理、基因编辑或培养条件改变后,细胞的粘附能力改变情况。

原理

机体内许多细胞,如上皮细胞固定在某处发挥功能;另一些细胞,如白细胞,活跃运动,就需要不断调节细胞粘附。细胞粘附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。

恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力,提示这些细胞相互识别及粘附机制发生了改变。将细胞种植于包被的培养板中,培养一段时间后去除未粘附细胞,可以检测细胞在模拟基质的表面粘附的细胞数变化,通过 MTT 比色法检测粘附细胞量从而反应粘附的细胞数,即可得出细胞粘附率。

用途

药物实验、基因转染、敲除或培养,肿瘤转移机制、细胞功能、细胞粘附、炎症机制等。

材料与仪器

各种规格移液器(0.5~10 μl、10~100 μl、100 μl~1 ml)、各种规格 Tip(10 μl、200 μl、1 ml)、96 孔板、 EP 管、超净工作台、二氧化碳培养箱和酶标仪、10 μg/ml fibronectin 纤连蛋白(或 collagen 胶原)、MTT、1% BSA、胰蛋白酶、PBS、FBS、无血清培养基、DMSO 和细胞等。

步骤

1、用预冷的无血清培养基将 fibronectin 配制成 10 μg/ml 的人工基底膜胶液,混匀后置于冰上备用。

2、96 孔板中每孔铺稀释过的 fibronectin 50 μl,超净工作台中风干过夜。

3、吸去包被液,加入 200 μl 1% BSA 在 37 ℃ 孵育孔板 1 h,用无血清的培养基浸洗孔板 3 次洗去多余的胶备用。

4、待测细胞(包括实验组和对照组)处理好后,0.25% EDTA 胰蛋白酶消化细胞,用无血清的培养基调整细胞悬液浓度,以 5×104 个/孔接种 96 孔板,每孔体积为 100 μl,同时设不加细胞只加培养液的空白对照孔。每组细胞设置 5 个重复孔,边缘孔用无菌 PBS 填充。

5、将细胞放入 37 ℃、5% CO2 培养箱内培养 30~60 分钟(可根据细胞状态和实验需求适当调整培养时间)。

6、取出细胞培养板,吸弃培养基,PBS 轻柔漂洗 3 遍,每孔加入 100 μl 新鲜培养基。

7、96 孔板中每孔加入 10 μl MTT 溶液(5 mg/ml ),37 ℃ 孵育 4 小时。

8、小心吸弃孔内培养上清液,每孔加 150 μl DMSO,摇床振荡 15 分钟,使结晶物充分溶解。

9、测定样品孔 OD 值。选择 490 nm 波长,用酶标仪测定各孔吸光值,记录结果。取各重复孔 OD 值的平均数。

10、计算细胞粘附率。

细胞粘附率 = [(实验组细胞 OD-空白 OD)/(对照组细胞 OD-空白 OD)]× 100%

注意事项

1、MTT 溶液用 PBS 现用现配,0.22 μm 滤器过滤后 4 ℃ 避光保存,两周内有效,或配制成 5 mg/ml 溶液,于 - 20 ℃ 长期保存。避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或铝箔纸包住 EP 管避光以免分解。

2、接种细胞过程中,应匀速轻柔滴加至孔中,进行「十」字晃动,保证细胞铺均匀。

3、用含血清的培养基终止消化,再用无血清培养基洗涤细胞并重悬。

来源:丁香实验

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