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🔥 细胞粘附实验(显微镜直接计数)

相关实验:细胞粘附实验

别名:Cell adhesion test

最新修订时间:

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合作专家 | 郭新容硕士

临床医学 中南大学

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审核专家 | 聂壹峰博士

纳米生物医学 中国科学院大学

简介

细胞粘附性是维持组织结构稳定的基本条件,也是细胞运动和发挥功能的调节因素,通常分细胞与细胞粘附和细胞与基质粘附。

原理

机体内许多细胞,如上皮细胞固定在某处发挥功能;另一些细胞,如白细胞,活跃运动,就需要不断调节细胞粘附。细胞粘附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力,提示这些细胞相互识别及粘附机制发生了改变。

用途

药物实验、基因转染、敲除或培养,肿瘤转移机制

材料与仪器

待检测细胞、无菌 6 孔培养板、Lipofectamine TM 2000、37LRP siRNA、培养箱、0.25% 胰酶、无血清 MEM 培养基、Matrigel、96 孔板、超净台、PBS 或生理盐水、甲醇、姬姆萨染液、蒸馏水、显微镜。

步骤

1、将 4.5×105 个细胞每孔 104 左右传代于无菌 6 孔培养板中。

2、培养 24 h 后,用 Lipofectamine TM 2000 将 37LRP siRNA 转染细胞中,转染后的细胞置 37℃、5% CO2 培养箱中培养,48 h 后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及未转染。转染终浓度即 siRNA 终浓度为 100 nmol/L。 

3、培养 48 h 后收集细胞,用 0.25% 胰酶将贴壁培养细胞(约 1×106 个)从壁上消化下来并制成单细胞悬液。 

4、用无血清 MEM 培养基将 Matrigel 配制成 10 μg / 250 μl(1:300)的人工基底膜胶备用。

5、96 孔板每孔中铺 Matrigel 2 μg / 50 μl,放于超净台中风干过夜。 

6、96 孔板每孔加入适量无血清 MEM 细胞培养液(或 PBS 或生理盐水),放置 60-90 min,洗去多余的胶。

7、取转染、阴性对照转染及未转染细胞以 4×103 /孔接种在铺胶的 96 孔板中,设 3 个重复孔,放入 37℃、5% CO2 培养箱中分别培养 20 min、40 min、60 min。 

8、在相应时间点取出 96 孔板,吸出培养液,用 PBS 洗 3 遍,洗去未粘附细胞。

9、每孔加入 100 μl 甲醇,固定 15 min。

10、每孔加入 100 μl 姬姆萨染液,染色 15 min,蒸馏水洗去染液。

11、显微镜下计数粘附细胞数量(每孔在固定位置取 8 个视野)。

 

 

 

 

注意事项

1、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。重悬细胞是动作要轻柔,避免多次反复的激烈吹打;

2、染色培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异;

3、染色程度要根据细胞种类而定;

4、加染液时注意尽量不要产生气泡。

来源:丁香实验

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