🔥 细胞粘附实验（显微镜直接计数）

细胞粘附性是维持组织结构稳定的基本条件，也是细胞运动和发挥功能的调节因素，通常分细胞与细胞粘附和细胞与基质粘附。

机体内许多细胞，如上皮细胞固定在某处发挥功能；另一些细胞，如白细胞，活跃运动，就需要不断调节细胞粘附。细胞粘附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力，提示这些细胞相互识别及粘附机制发生了改变。

药物实验、基因转染、敲除或培养，肿瘤转移机制

待检测细胞、无菌 6 孔培养板、Lipofectamine TM 2000、37LRP siRNA、培养箱、0.25% 胰酶、无血清 MEM 培养基、Matrigel、96 孔板、超净台、PBS 或生理盐水、甲醇、姬姆萨染液、蒸馏水、显微镜。

1、将 4.5×10⁵ 个细胞每孔 10⁴ 左右传代于无菌 6 孔培养板中。

2、培养 24 h 后，用 Lipofectamine TM 2000 将 37LRP siRNA 转染细胞中，转染后的细胞置 37℃、5％ CO₂ 培养箱中培养，48 h 后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及未转染。转染终浓度即 siRNA 终浓度为 100 nmol/L。 

3、培养 48 h 后收集细胞，用 0.25% 胰酶将贴壁培养细胞（约 1×10⁶ 个）从壁上消化下来并制成单细胞悬液。 

4、用无血清 MEM 培养基将 Matrigel 配制成 10 μg / 250 μl（1:300）的人工基底膜胶备用。

5、96 孔板每孔中铺 Matrigel 2 μg / 50 μl，放于超净台中风干过夜。 

6、96 孔板每孔加入适量无血清 MEM 细胞培养液（或 PBS 或生理盐水），放置 60－90 min，洗去多余的胶。

7、取转染、阴性对照转染及未转染细胞以 4×10³ /孔接种在铺胶的 96 孔板中，设 3 个重复孔，放入 37℃、5％ CO₂ 培养箱中分别培养 20 min、40 min、60 min。 

8、在相应时间点取出 96 孔板，吸出培养液，用 PBS 洗 3 遍，洗去未粘附细胞。

9、每孔加入 100 μl 甲醇，固定 15 min。

10、每孔加入 100 μl 姬姆萨染液，染色 15 min，蒸馏水洗去染液。

11、显微镜下计数粘附细胞数量（每孔在固定位置取 8 个视野）。

1、细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。重悬细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打；

2、染色培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异；

3、染色程度要根据细胞种类而定；

4、加染液时注意尽量不要产生气泡。