🔥 细胞粘附检测－荧光法

细胞粘附是指细胞通过细胞表面的特化分子相互作用并附着到邻近细胞的过程。可分为细胞直接接触和通过细胞外基质发生连接。

在细胞增殖、维持活性、分化和迁移中具有关键作用。细胞黏附荧光法是通过活细胞荧光探针染色黏附的活细胞数量来反应细胞的黏附能力变化。

通过细胞粘附研究可能找到治疗癌症的潜在治疗靶点。

试剂耗材：

① 实验细胞

② PBS

③ 1% BSA

仪器设备：

① 荧光酶标仪

② 离心机

③ 移液器

④ 冰箱

⑤ 冰盒

⑥ 离心管

⑦ 吸头

⑧ 钙黄绿素试剂

实验的具体步骤：细胞接种及处理、黏附率检测。

1、细胞接种

（1）将实验细胞进行处理，用胰酶消化后，用 PBS 洗涤后，收集到离心管中 1 000 rpm、5 min 并用相应的细胞培养基重悬，制成细胞悬液。

（2）按每孔 5 × 10⁴ 细胞接种 96 孔板（具体细胞接种数目依据细胞特性和实验目的进行调整，检测前对照组细胞数量达到 80~90%），建议设置 3~5 个复孔。同时设立对照组、药物处理组、空白对照组。对照组即溶剂处理组，空白对照组为不含细胞且更换正常细胞培养基，其他处理一致。

（3）将细胞放 37 ℃ 培养箱孵育培养 24 h，依照实验目的分别处理对照组和药物处理组，后进行荧光染色观察不同组别荧光强度。

2、粘附率检测

（1）工作液的配制，从冰箱取出荧光染色（钙黄绿素）试剂，加入 DMSO 制成储存液。并按照所测样品用量加入粘附测定缓冲液制成工作液，储存液可以 -20 ℃ 下保存。

（2）取出细胞培养板，吸弃培养基。并用 PBS 洗涤 2~3 次后，加入每孔加入 100 μL 钙黄绿素工作溶液，孵育培养 20~30 min 后，去除上清液后，加入 PBS 清洗细胞。

（3）用荧光酶标仪检测结果。最大激发波长 488 nm，最大发射波长分别为 520 nm。

（4）细胞粘附率计算。将各测试孔的荧光强度值减去空白孔（未加细胞孔）荧光强度值。各重复孔的荧光强度值取平均数。

细胞粘附率 =（（F 药物处理细胞 - F 空白）/（F 对照细胞 - F 空白））× 100%

（1）离心细胞速度不能太快，还有吹打细胞时动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打，同时不用涡旋振荡器，减少细胞受损风险。

（2）染色培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。

（3）忘记封闭，或封闭时间较短，使实验受抗体非特异性结合的影响。

（4）若细胞在染色后于不含染料的培养基中孵育，荧光信号会衰减。

（5）在孵育抗体的时候忘记避光。

（6）钙黄绿素母液可以进行小量分装，每次使用一管，试剂于 -20 ℃ 避光冻存，避免反复冻融。

（7）钙黄绿素工作液要现配现用。

（8）注意洗涤细胞时用 PBS 进行反复洗涤，减少培养基中血清的影响。