四唑盐（MTT）比色法

四唑盐（MTT）：噻唑蓝

原理：MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法.活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与活细胞数成正比。

优点：简单快速、灵敏、经济

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT主要有两个用途

1. 药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；

通常，此法中的MTT 浓度为5 mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。配制成5 mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

普通MTT法实验步骤：

1. 接种细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1 000-10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积200 ul。

2. 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3. 呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5 mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20 ul，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150 ul DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。

4. 比色：选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

药物MTT法实验步骤

贴壁细胞：

1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 ul，铺板使待测细胞调密度 1 000- 10 000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2. 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100 ul，设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况

3. 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4. 吸出培养液.每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5. 终止培养，小心吸去孔内培养液。

6. 每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。

7. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

悬浮细胞：

1. 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40 ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培养液稀释 (储存液100 mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10 ul；④细胞悬液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100 ml 1640）

2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光值）

4. 离心（1000转x10 min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使

结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570 nm（630 nm校准）测量各孔的吸光值。

5. 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

MTT结果分析

关于如何计算IC50

1、改良寇式法：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm：lg 最大剂量

I：lg(最大剂量/相临剂量)

P：阳性反应率之和

Pm：最大阳性反应率

Pn：最小阳性反应率

举个例子：各药物浓度作用于某肿瘤细胞后所得MTT值如下

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值，如对于100 ug/ml的药物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各组抑制率如下：

代入计算公式：

Pm=0.869

Pn=0.135

P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

Xm=lg100=2

lgI=lg100/50=0.301

lgIC50=2-0.30undefined(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655

IC50=45.186

该药物的IC50值为45.186 ug/ml

注意事项

1. 选择适当的细胞接种浓度，保证细胞培养结束时浓度不至于过满。

2. 种板技术：均匀。

3. 实验时应设置调零孔，溶媒孔，加药孔。

调零孔：培养基、MTT、DMSO。（无细胞）

溶媒孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、溶酶。

加药孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、不同浓度的药物。

（一般5-7个梯度，设3-5个复孔）

4. 避免血清干扰：一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。

5. 边缘效应：周边孔加入PBS。

6. MTT的配置： MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液。4℃下避光保存2周。

7. 孔板的重复利用(1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心最好让洗衣粉先化开）。2.用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干.3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液(六小时以上即可)后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。或泡酸过夜，dd水冲洗干净，烘干或者晾干后紫外照射30min以上即可使用。

8. MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

9. 在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

10. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套。

11. 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以操作台上的照明灯关掉。

实验前应明确的问题

1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4. 培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。

7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8. 避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

9. 细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。

10. MTT细胞密度多采用10 000/ml，100 ul/孔(最佳点板浓度在4 000-5 000/孔)。

11. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是MTT实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。

12. 加完MTT反应3－4h后，从培养箱取出96孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶,使其滑落.你可以试着将96孔板倾斜30度角，然后用枪尖慢慢吸，有的细胞可以用排枪一起吸，有的则要耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落

13. 用医用的注射器加上针头吸取液体的，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取就好了！这次MTT我用1 ml针头仔细吸培养液,觉得比其它方法可靠,一般不会吸走紫色结晶.

14. 96孔板洗的次数多了，板底自然留下划痕，这就会导致读数的不均而影响实验结果。你不妨在做实验前测一次96孔板的值(此值为初值)，实验测得的为后值。后值减去初值就接近实验的真实值。

MTT测生长曲线

生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数。通常计数7 d。为精确起见，一般每次计数3瓶细胞并取平均值。典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指教生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。 除使用计数法测定细胞的生长曲线外，还可用MTr比色法间接测量之。MTT比色法的主要原理是：MTr被活细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶还原后，生成暗蓝色甲瓒，甲瓒被助溶剂溶解后，可在酶标仪上读取光吸收值(OD)，在一定范围内光吸收值(OD)与活细胞数量呈线性关系。所以可以通过测量OD值，间接测量活细胞数量。 生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。一般在对数生长期的1/3－1/2处加药。细胞计数的时间和次数则依实验目的而定。

(一) 细胞生长曲线测定(计数法)

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2 000个/毫升，在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。(将样品适当稀释后，用稀释后的样品和0.4％的台盼兰溶液按1:1混合后，用移液枪点样到血球计数板，置于倒置显微镜下观察、计数)。

1. 取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数(见四、细胞传代培养的实验步骤)。如是非粘壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。

2. 根据细胞计数结果按每个小方瓶5×104/mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。

3. 24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7 d。

4. 根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

(二)细胞生长曲线测定(MTT法)

1. 制备1 mL细胞悬液。空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。加入0.1 mL MTT于37℃孵育4 h。使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。

2. 加1 mL DTW脱色液，37℃至少静置30 min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解。

3. 吸取200 μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。

4. 每隔24 h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值