四唑盐（MTT）比色法

四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝

操作步骤

一、接种细胞

1、用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。

2、离心细胞悬液，使细胞沉积下来。用培养基重悬细胞，计数。

3、将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml，每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。

4、用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞。

5、将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。第1列作读板议的空白对照。

6、将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物。

二、添加药物

1、用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。

2、对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列各孔的培养基。

3、在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。

4、在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物，E-H行用于第二种药物。

5、向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。

6、将培养板放回塑料盒中，温育至确定时间。

三、生长期

1、在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μl新鲜的培养基。

2、每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。

四、存活细胞数的估算

1、在生长期末，每孔中各加入200μl新鲜的培养基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。

2、用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境中温育4 h。

3、弃去孔中的培养基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解残留的MTT-甲臜结晶。

4、在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）。

5、立即在570nm处记录吸光值。读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零。

五、分析

以药物浓度为横坐标（X轴），吸光值为纵坐标（Y轴）绘制曲线图。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度。

四唑盐比色法的原理

活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

无菌材料

生长液；胰蛋白酶（0.25%+EDTA，1mmol/L，溶于PBSA中）；MTT： 3- (4，5) -双甲基 - 2 -噻唑 - (2 ，5) -二甲苯基溴化四氮唑，50mg/ml，滤过除菌; Sorensen 甘氨酸缓冲液（0.1mol/L甘氨酸， 0.1mol/L NaCl，用1mol/L NaOH将PH调至10.5 ）；微滴定板（Linbro，ICN）；微吸头，最好放在高压灭菌的吸头盒中。

非灭菌材料

塑料盒（无毒的聚苯乙烯，装培养板用）；加样