聚合酶链式反应（PCR）

1. 检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态；

2. 有效检测癌基因的突变，准确检测癌基因的表达量；

3. 临床应用于检测地中海贫血的基因突变。

PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR 由变性 -- 退火 -- 延伸三个基本反应步骤构成：

1. 模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 94 ℃ 左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

   
   

2. 模板 DNA 与引物的退火 (复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55 ℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；

   
   

3. 引物的延伸：DNA 模板 -- 引物结合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性 -- 退火 -- 延伸三过程，就可获得更多的「半保留复制链」，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟， 2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

假阴性，不出现扩增条带

1. 模板原因

① 模板中含有杂蛋白质。

② 模板中含有 Taq 酶抑制剂。

③ 模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。

2. 酶失活

① 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

② 忘加 Taq 酶或溴乙锭。

3. 引物

① 引物质量。

② 引物的浓度。

③ 两条引物的浓度是否对称。

解决对策

① 选定一个好的引物合成单位。

② 引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。