【转帖】聚合酶链式反应（PCR）
丁香园论坛
2297
PCR扩增技术，即聚合酶链式反应，是美国科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 现在的PCR扩增不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
PCR扩增技术的基本原理
PCR扩增，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
模板DNA的变性：模板DNA经加热至93 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
引物的延伸：DNA模板--引物结合物在聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4 min，2-3 h就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
PCR扩增反应体系与PCR反应条件
参加PCR反应的物质主要有五种：引物、PCR扩增酶、dNTP模板和Mg2+。
PCR扩增引物
引物是PCR特异性反应的关键，PCR 反应产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
PCR扩增酶及其浓度
目前有两种聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化典型的PCR反应约需酶量2.5 U（指总反应体积为100 μl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
PCR扩增时dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1 M NaOH或1 M Tris HCL的缓冲液将其PH调节到7.0-7.5，小量分装，-20 ℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP浓度应为50-200 μmol/L，尤其注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR反应产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
[url=Documents and Settings\Administrator\桌面]
PCR扩增模板（靶基因）核酸
PCR扩增模板核酸的量与纯化程度，是PCR扩增成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K[/url]来消化处理标本。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
PCR扩增Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200 μmol/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低聚合酶的活性，使反应产物减少。
如何防止PCR反应的污染？
A：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。
防止污染的方法：
(一)合理分隔实验室：将样品的处理、配制PCR反应液、PCR 循环扩增及PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开，最好能划分①标本处理区；②PCR反应液制备区；③PCR循环扩增区；④PCR产物鉴定区。PCR扩增实验用品及吸样枪应专用。PCR扩增实验前应将实验操作台用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或RNA。
(二)吸样枪：PCR扩增吸样枪污染是一个值得注意的问题。操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(三)预混和分装PCR 试剂：所有的PCR扩增试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR扩增试剂，PCR扩增反应液应与样品及PCR扩增产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱中。
(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、枪头和PCR反应管。
(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照。
(六)减少PCR 循环次数，只要PCR扩增产物达到检测水平就可以停止反应。
(七)选择质量好的PCR反应管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。
Q：PCR反应引物的设计应遵循哪些原则？
A：1、引物长度：15-30 bp，常用为20 bp左右。
2、引物扩增片段跨度：以200-500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10 kb的片段。
3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
5、引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR扩增失败。
6、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1-1 μmol或10-100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，增加引物之间形成二聚体的机会。
Q：如何选择PCR反应温度及时间？
A：PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
基于PCR原理步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90-95 ℃变性，再迅速冷却至40-60 ℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70-75 ℃，在聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100-300 bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸（此温度聚合酶仍有较高的催化活性）。
1、变性温度与时间
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93-94 ℃ l min足以使模板DNA变性，若低于93 ℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步骤若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
2、退火（复性）温度与时间
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40-60 ℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板与互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55 ℃为最适退火温度。引物的复性温度可通过以下公式帮助计算：
Tm值=4（G+C）＋2（A+T）
复性温度=Tm值-（5-10 ℃）
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30-60 s，足以使引物与模板之间完全结合。
3、延伸温度与时间
PCR反应的延伸温度一般选择在70-75 ℃之间，常用温度为72 ℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1 kb以内的Dundefined*段，延伸时间1 min足够了，3-4 kb的靶序列需3-4 min；扩增10 kb需延伸至15 min。延伸时间过长会导致非特异性扩增条带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
Q：PCR反应中循环次数怎样确定？
A：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR扩增技术的基本原理
PCR扩增，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
模板DNA的变性：模板DNA经加热至93 ℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4 min，2-3 h就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。PCR扩增反应体系与PCR反应条件
参加PCR反应的物质主要有五种：引物、PCR扩增酶、dNTP模板和Mg2+。
PCR扩增引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR 反应产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
PCR扩增酶及其浓度目前有两种聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化典型的PCR反应约需酶量2.5 U（指总反应体积为100 μl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
PCR扩增时dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1 M NaOH或1 M Tris HCL的缓冲液将其PH调节到7.0-7.5，小量分装，-20 ℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP浓度应为50-200 μmol/L，尤其注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR反应产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
[url=Documents and Settings\Administrator\桌面]
PCR扩增模板（靶基因）核酸PCR扩增模板核酸的量与纯化程度，是PCR扩增成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K[/url]来消化处理标本。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
PCR扩增Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200 μmol/L时，Mg2+浓度为1.5-2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低聚合酶的活性，使反应产物减少。
如何防止PCR反应的污染？A：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。
防止污染的方法：
(一)合理分隔实验室：将样品的处理、配制PCR反应液、PCR 循环扩增及PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR 产物的鉴定应与其它步骤严格分开，最好能划分①标本处理区；②PCR反应液制备区；③PCR循环扩增区；④PCR产物鉴定区。PCR扩增实验用品及吸样枪应专用。PCR扩增实验前应将实验操作台用紫外线消毒以破坏残留的DNA 或RNA。
(二)吸样枪：PCR扩增吸样枪污染是一个值得注意的问题。操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
(三)预混和分装PCR 试剂：所有的PCR扩增试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR扩增试剂，PCR扩增反应液应与样品及PCR扩增产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱中。
(四)防止操作人员污染，使用一次性手套、枪头和PCR反应管。
(五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照。
(六)减少PCR 循环次数，只要PCR扩增产物达到检测水平就可以停止反应。
(七)选择质量好的PCR反应管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。
Q：PCR反应引物的设计应遵循哪些原则？
A：1、引物长度：15-30 bp，常用为20 bp左右。
2、引物扩增片段跨度：以200-500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10 kb的片段。
3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
5、引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR扩增失败。
6、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1-1 μmol或10-100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，增加引物之间形成二聚体的机会。
Q：如何选择PCR反应温度及时间？
A：PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
基于PCR原理步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90-95 ℃变性，再迅速冷却至40-60 ℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70-75 ℃，在聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100-300 bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸（此温度聚合酶仍有较高的催化活性）。
1、变性温度与时间
变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93-94 ℃ l min足以使模板DNA变性，若低于93 ℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步骤若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
2、退火（复性）温度与时间
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40-60 ℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板与互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55 ℃为最适退火温度。引物的复性温度可通过以下公式帮助计算：
Tm值=4（G+C）＋2（A+T）
复性温度=Tm值-（5-10 ℃）
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30-60 s，足以使引物与模板之间完全结合。
3、延伸温度与时间
PCR反应的延伸温度一般选择在70-75 ℃之间，常用温度为72 ℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1 kb以内的Dundefined*段，延伸时间1 min足够了，3-4 kb的靶序列需3-4 min；扩增10 kb需延伸至15 min。延伸时间过长会导致非特异性扩增条带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
Q：PCR反应中循环次数怎样确定？
A：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
