简介
荧光定量 PCR 技术, 是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过 Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
原理
荧光定量聚合酶链式反应检测可溶性细胞因子的基本原理是利用 SYBR Green I-荧光定量 PCR 最常用的 DNA 结合染料，与双链 DNA 非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光，一旦与双链 DNA 结合，其荧光增加 1000 倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链 DNA 量呈正比，且随扩增产物的增加而增加。
用途
双链 DNA 结合染料实验设计简单, 仅需要 2 个引物，不需要设计探针，且能够进行熔点曲线分析，成本低，通用性好，在科研中使用比较普遍。
材料与仪器
器材：PCR 仪，移液器。
试剂：
① 1 x PCR Buffer
② 0.3-0.5pmol/μl 的引物
③ 0.1-0.3pmol/μl 的探针
④ 2.5-4.OmM 的 Mg2+
⑤ 1-2U 的 Taq 酶
⑥ 0.2-0.4 mM 的 dNTPs
⑦ 0.2-1.0U 的 UNG 酶
⑧ 0.3-0.6 mM dUTP
步骤
(一) 基因序列的査找
大量阅读相关的背景资料后，根据自己所要研究的基因名称，在 genebank 中找到相应的基因序列（www.ncbi.nlm.nih.gov）。用引物设计软件 Primer 5.0、o1igo 6.0 或 Beacon Designs 3.0 进行引物探针的设计（该软件可在 www.shinegene.org.cn 下载）
(二) 引物设计通常遵守的原则
①引物与模板的序列要紧密互补;
②引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；
③引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应（即错配）；
④引物长度通常在 20-25bp,Tm 值在 55℃-65℃，GC 含量在 40%-60%，产物大小在 100-250bp 之间；
⑤引物的 3』端避免使用碱基 A，避免出现 3 个以上连续相同的碱基;
⑥为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
探针设计通常遵守如下原则：
①探针位置尽可能地靠近上游引物;
②探针长度通常在 20-30bp,Tm 值在 65℃-70℃，通常比引物高 5℃-10℃,GC 含量在 40%-70%；
③探针的 5』端应避免使用碱基 G；
④整条探针中，碱基 C 的含量要明显高于 G 的含量。
(三) 为确保引物探针的特异性
最好将设计好的序列在 blast 中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
(四) 根据仪器特点和个人的喜好选择标记的荧光素种类
如 FAM、Texas red、LC-Red640、LC-Red705 等，同时确定荧光定量 PCR 的方法，选择 Taqman 或 beacon 等，可参考前面所述。
(五) 选择高品质的引物探针合成商，如 TaKaRa 等。
(六) 三种外标准品的制备形式
①化学合成目的基因，它的优点是纯度高、定量准确，缺点是受化学合成工艺的限制，只能合成 120bp 以下的长度;
②将 PCR 扩增产物直接梯度稀释, 它的优点是方便、简单，缺点是不准确、不稳定；
③将 PCR 产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，进行定量，优点是稳定、准确。
(七) 引物探针的保存合成好的引物探针
最好用双蒸水稀释成 25pmol/μl 的浓度，然后放-20℃ 保存，还应该注意避光保存探针。
(八)PCR 反应液的配制
1xPCR Buffer、0.3-0.5pmol/μl 的引物、0.1-0.3pmol/μl 的探针、2.5-4.OmM 的 Mg2+、1-2U 的 Taq 酶、0.2-0.4 mM 的 dNTPs、O.2-1.0U 的 UNG 酶、0.3-0.6 mM dUTP、通常取 2-5μl 的模板，反应总体积通常为 20-50μl(以上所有的浓度都是指终浓度)。
(九)PCR 扩增程序的设定
通常是先 50℃，2 min，93℃，5s, 然后 93℃,20s，60℃，30s，循环 40 次，在 60℃ 时，设定荧光检测点。
(十) 阴性对照设定
为确保实验数据的有效性，每次实验都设阴性对照和 4 个标准品，每个样品都平行做 2 个复孔。
(十一) 基线或阀值的设定
通常是以 10-15 个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线
注意事项
1. 文献上引物和探针序列的使用问题。
通常国外的文献可信度比较高，可直接使用；但为了保险起见，最好用 blast 对引物探针的序列进行必要的验证；或者用 primer 软件对引物探针的二级结构和退火温度进行分析，这样更有利于对整个实验的把握。
2. 在实验之前的准备工作。
首先要不加探针做常规的 PCR 实验，验证引物是否工作、模板是否降解、模板纯度是否合适，同时确定实验的最佳反应体系和反应条件。
3. 标本的釆集和处理的注意事项。
根据实验要求和目的，有针对性采集病灶部位的标本；采集好的标本，最好根据每次实验用量, 用冻存管分成几小份，放在-80℃ 保存，以免反复冻融；标本通常分成 3 类 (细胞组织、分泌物、血清全血)；如果是血清，不能有融血现象的发生，否则会影响 PCR 的扩增；如果是全血，最好不用 EDTA 作为抗凝剂，选用柠檬酸作为抗凝剂，否则会影响 PCR 的扩增；如果是组织，最好用蛋白酶 K 消化；如果是提 RNA 的标本, 更应该防止反复冻融和保持标本的新鲜。
4. 荧光定量实验操作的注意事项。
在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套、一次性移液器吸头 (带滤嘴自卸式)，不能用手直接触摸离心管底部。在试剂准备和标本处理时应使用超净工作台 (负压式) 或防污染罩，以防止对环境的污染。操作台、移液器、离心机、PCR 扩增仪等仪器设备应经常用 10% 次氯酸或 75% 乙醇擦拭消毒。每次实验前后用 10% 次氯酸和 70% 乙醇擦拭移液器、操作台。实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置、专人保管, 废弃物应置专门容器中妥善处理。荧光探针应避光保存，加入反应液中后, 应尽快配制好反应体系进行扩增。配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡。
来源：丁香实验
