Th17细胞的分化诱导

一类CD4T细胞主要分泌IL-17，表达控制其分化的独特的转录因子-孤独受体（orphan nuclear receptor，RORYt）。

Th17细胞分泌IL-17，刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等分泌多种细胞因子，趋化和募集中性粒细胞和单核细胞，诱导局部炎症反应。

因此，Th17参与了炎症反应、感染性疾病以及自身免疫性疾病的发生发展。另一方面，IL-17刺激上皮细胞、角朊细胞分泌防御素等抗菌物质，以及募集和活化中性粒细胞等，在固有免疫中发挥重要作用。

Th17细胞的分化诱导的基本原理是先将Th0细胞进行活化，同时加入TGF-β、IL-6、抗IFN-y和抗IL-4等相应的条件促进Th17的分化。

另外有些对Th17的分化发育与功能具有重要作用的细胞因子，如IL-23和IL-21，也可被加人到诱导分化的过程中。

试剂：

1.C57BL／6J小鼠（雌性，6～8周龄，SPF级）

2. 抗CD3、抗IL-4及抗IFN-y抗体

3. rh TGF-β1、rm IL-6

4. 含10％ FBS的RPMI 1640完全培养基

5. PMA

6. Ionomycin

7. Brefeldin A

仪器：

1. 96孔细胞培养板

Th17细胞的分化诱导的基本过程可分为以下几步（用抗CD3抗体联合抗原提呈细胞来活化Th0细胞并诱导Th17细胞的分化方法）：

（1）包被：诱导分化的前一天，用终浓度为5 μg／ml抗CD3抗体包被96孔圆底细胞培养板，4 ℃过夜。

（2）初始细胞的制备：取C57BL／6J小鼠的脾脏并制成单细胞悬液，采用磁珠分选CD4＋细胞，获得CD4＋细胞后用含10％ FBS的RPMI 1640调整细胞浓度为2x10⁶个／ml，在96孔细胞培养板的每孔中加入50 μl的CD4＋细胞（1x10个），每组设3个复孔。

（3）每孔加入终浓度为2 μg／ml的抗CD28抗体，加入终浓度为2 ng／ml的rm TGF-β、终浓度为30 ng／ml的IL-6、终浓度为50 ng／ml的IL-23，终浓度为10 μg／ml的抗IFN-Y抗体和终浓度为10μg／ml的抗IL-4抗体。

（4）用含10％ FBS的RPMI 1640将每孔的总体积均补至200 μl，混匀后将96孔圆底细胞培养板置于37 ℃、5％ CO₂的细胞培养箱中培养4天。

（5）培养4天后收集分化的Th17细胞，鉴定相应的细胞因子IL-17的分泌情况。常用的方法同前。

（6）将分化的细胞采用诱导时相同的活化方式对细胞进行再刺激，活化24小时后收集上清，ELISA检测上清中IL-17的水平。

（7）采用胞内染色法检测细胞内各种细胞因子的表达情况，即将细胞采用5 ng／ml PMA、500 ng／mlIonomycin 和 10 μg／ml Brefeldin A共存在的条件下再刺激4小时。

然后采用荧光标记的抗IL-17抗体进行胞内染色标记，通过流式细胞仪上样检测分析。

实验中各种细胞因子与阻断性抗体应确保其良好活性，可在-20 ℃或-80 ℃环境下保存，同时应避免反复冻融。